(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210981857.0 (22)申请日 2022.08.16 (83)生物保 藏信息 CGMCC No.40140 202 2.04.24 (71)申请人 哈尔滨市农业科 学院 地址 150029 黑龙江省哈尔滨市松北区万 宝大道5399号 (72)发明人 庄磊　 (74)专利代理 机构 黑龙江立超同创知识产权代 理有限责任公司 23217 专利代理师 杨立超　冉雪娇 (51)Int.Cl. A01G 18/20(2018.01) A01G 18/00(2018.01) A01G 18/40(2018.01)A61K 36/07(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C12N 1/14(2006.01) C12N 13/00(2006.01) C12N 15/01(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 一种基于野生刺槐范氏孔菌的诱变方法、 刺 槐范氏孔菌的栽培方法、 刺槐范氏孔菌及其应用 (57)摘要 本发明提供一种基于野生刺槐范氏孔菌的 诱变方法、 刺槐范氏孔菌的栽培方法、 刺槐范氏 孔菌及其应用， 属于刺槐范氏孔菌技术领域。 为 解决刺槐范氏孔菌子实体难以人工培育， 诱变效 果较差问题。 通过60Co‑γ对含有野生刺槐范氏 孔菌原液的野生刺槐范氏孔菌孢子悬液诱变， 诱 变后刺槐范氏孔菌在母种培养基中培育后经过 培育后获得新品种刺槐范氏孔菌。 实现刺槐范氏 孔菌子实体人工培育； 通过添加野生刺槐范氏孔 菌原液后提高耐受性， 进而提高诱变效果； 通过 拮抗试验可知， 获得的刺槐范氏孔菌为新品种刺 槐范氏孔菌， 保藏编号为CGMCC  No.40140； 连续 二年栽培 试验结果表明， 刺槐范氏孔菌新品种性 状稳定， 子实体 亩产可达10 00斤。 权利要求书2页 说明书11页 附图7页 CN 115316196 A 2022.11.11 CN 115316196 A 1.一种基于野生刺槐 范氏孔菌的诱变方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 步骤一、 将野生刺槐范氏孔菌的孢子溶于无菌的生理盐水中进行稀释， 并用血球计数 板计数， 稀释至孢子悬 液中孢子的浓度量级为107mL/个‑108mL/个， 得到孢子悬 液； 步骤二、 制备诱变培养基： 诱变培养基由以下重量份的原料组成： 野生刺槐范氏孔菌原 液为5‑15份， 玉米淀粉为35 ‑40份、 麦麸为15 ‑25份、 蔗糖为8 ‑12份、 葡萄糖为8 ‑12份、 磷酸二 氢钾为1.8 ‑2.2份、 硫酸镁为0.9 ‑1.1份、 酵母粉为5 ‑7份、 VB1为0.008 ‑0.012份、 琼脂为16 ‑ 20份和水为80 0‑1200份， 控制所述 诱变培养基的ph值 为6.3‑6.5； 与所述孢子同株的野生刺槐范氏孔菌子实体与水按质量比为1:(5 ‑10)混合后煮沸、 过 滤， 得到野生刺槐 范氏孔菌原液； 步骤三、 将所述孢子悬液与步骤一所述孢子同株的野生刺槐范氏孔菌的菌丝同时接种 于同一诱变培养基内， 所述孢子悬液与诱变培养基的体积比为 1： (2‑3)， 然后在26℃的温度 下培养2d后， 再利用60Co‑γ射线照射， 照射剂量为1150Gy ‑1200Gy， 照射三次， 时间间隔为2 小时， 三次照射时间依次为20s、 40s、 6 0s， 得到诱变后刺槐 范氏孔菌 。 2.根据权利要求1所述的一种基于野生刺槐范氏孔菌的诱变方法， 其特征在于， 还包括 步骤四： 将得到的诱变后刺槐范氏孔菌在步骤二中的诱变培养基中再次进行培育， 连续传 代至少3次后， 获得遗传稳定的诱变后刺槐 范氏孔菌 。 3.一种刺槐 范氏孔菌的栽培方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)母种培育， 将诱变后刺槐范氏孔菌无菌接入母种培养基进行组织培养， 再经过6d ‑ 8d的纯化， 菌种长满试管， 获得刺槐范氏孔菌纯母种； 所述纯化步骤为： 诱变后刺槐范氏孔 菌在母种培养基进行组织培养时保持温度为24℃ ‑28℃， 培养3d ‑4d长出白色绒毛状菌丝 体， 当菌丝延伸到母种培养基上后， 用接菌针挑取菌丝顶端部分， 接菌到新的母种培养基 上； 所述母种培 养基为添加了槐树皮汁和蛋白胨的复合CP DA培养基； (2)原种制备， 将刺槐范氏孔菌纯母种进行活化和扩繁， 然后接入原种培养基， 在温度 为25℃‑28℃的培 养室内培 养， 培养时间25d ‑30d， 获得刺槐 范氏孔菌原种； (3)栽培种制备， 将刺槐范氏孔菌原种接入栽培种培养基， 在温度为25℃ ‑28℃的培养 室内培养， 培养时间为25d ‑30d， 获得刺槐 范氏孔菌栽培种； (4)出耳管理与采收， 将刺槐范氏孔菌栽培种继续培养10d ‑12d后移至出菇房出菇， 出 菇期间保持通 风和湿度， 待长出的子实体有大量白色孢子弹射， 且菌 盖不再增大时采收。 4.根据权利要求3所述的一种刺槐范氏孔菌的栽培方法， 其特征在于， 所述复合CPDA培 养基由以下重量份的原料 组成： 新鲜马铃薯200 ‑250份、 槐树皮20 ‑25份、 水1000 ‑1500份、 葡 萄糖18‑22份、 琼脂18 ‑22份、 磷酸 二氢钾1.8 ‑2.2份和硫酸镁0.8 ‑1.5份。 5.根据权利要求4所述的一种刺槐范氏孔菌的栽培方法， 其特征在于， 所述复合CPDA培 养基的制备方法为： 将新鲜马铃薯洗净去皮后切碎， 得到马铃薯块； 将200g ‑250g马铃薯块 和20g‑25g槐树皮加入1L ‑1.5L水煮沸25min ‑35min， 经过纱布过滤后的滤液加水补足至1L， 再加入18g ‑22g葡萄糖、 18g ‑22g琼脂、 1.8g ‑2.2g磷酸二氢钾和0.8g ‑1.5g硫酸镁后加热充 分溶解得到未灭菌的复合CPDA培养基， 将未灭菌的复合CPDA培养基进行分装到试管， 每支 试管约分装5mL ‑10mL； 将分装未灭菌的复合CPDA培养基试管经121℃灭菌20分钟后， 取出试 管摆斜面， 冷却后储 存备用。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115316196 A 26.根据权利要求5所述的一种刺槐范氏孔菌的栽培方法， 其特征在于： 母种培养期间保 持温度24℃ ‑28℃， 相对空气湿度控制在75％以下， 且避光培 养。 7.根据权利要求6所述的一种刺槐范氏孔菌的栽培方法， 其特征在于， 所述原种培养基 和栽培种培养基均包括： 杂木屑75份 ‑80份， 麸皮13份 ‑17份， 麦麸或黄豆粉4份 ‑5份， 蔗糖1 份‑1.5份， 石 膏粉0.5份 ‑1.5份， 所述原种培 养基包括的PH值 为5‑6， 含水量 为55％‑60％。 8.一种刺槐范氏孔菌(Vanderbylia  robiniophila)， 所述刺槐范氏孔菌通过权利要求 1所述诱变方法培育， 其特征在于： 保藏编号为CGMCC  No.40140， 保藏在中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心， 保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 保藏时间为 2022年4月24日。 9.一种刺槐范氏孔菌的应用， 其特征在于： 所述刺槐范氏孔菌的子实体用于制备抗肿 瘤药物。 10.根据权利要求9所述的一种刺槐范氏孔菌的应用， 其特征在于： 所述抗肿瘤药物包 括治疗肝癌、 肺癌、 骨癌、 乳腺癌和胰腺癌的药物。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115316196 A 3