(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210883129.6 (22)申请日 2022.07.26 (71)申请人 华中科技大 学同济医学院附属协和 医院 地址 430022 湖北省武汉市解 放大道127 7 号 (72)发明人 孙岩　金鑫　 (74)专利代理 机构 济南驯致 一川知识产权代理 事务所 (特殊普通合伙) 37396 专利代理师 王砚雷 (51)Int.Cl. C12N 15/85(2006.01) C12N 15/62(2006.01) A61K 48/00(2006.01)A61K 38/17(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种小分子肽的融合质粒及其在抗肿瘤药 物中的应用 (57)摘要 本发明公开了一种小分子肽的融合质粒及 其在抗肿瘤药物中的应用， 主要涉及生物工程领 域。 制备方法为对GFP利用限制性内切酶消化获 得线性化载体； 基于PCSK9第59 3‑618位的氨 基酸 使用PCR扩增获得目的基因片段； 以线性化载体 和目的基因扩增产物配制反应体系， 进行重组反 应， 实现线性化载体和目的基因片段的体外环化 并获得重组产物； 提纯得高纯度质粒。 本发明的 有益效果在于： 它能够和PCSK9竞争发生棕榈酰 化修饰并且 恢复PTEN的表达 。 权利要求书1页 说明书7页 附图4页 CN 115109799 A 2022.09.27 CN 115109799 A 1.一种小分子肽的融合质粒， 其特 征在于， 通过以下 方法获得： 对GFP利用限制性内切酶消化获得线性 化载体； 基于PCSK9第593 ‑618位的氨基酸使用PCR扩增获得目的基因片段； 以线性化载体和目的基因扩增产物配制反应体系， 进行重组反应， 实现线性化载体和 目的基因片段的体外环化并获得重组产物； 提纯得高纯度质粒。 2.根据权利要求1所述一种小分子肽的融合质粒， 其特征在于， 所述PCR扩增的引物序 列为： ACG GGCCCTCTAGACTCGAGCGC CACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG。 3.根据权利要求1所述一种小分子肽的融合质粒， 其特征在于， 所述PCR扩增引物在其 5’端添加同源重组序列， 使用该引物扩增目的基因片段， 扩增产物5 ’和3’最末端的序列分 别不线性 化克隆载体两末端序列完全一 致。 4.根据权利要求1所述一种 小分子肽的融合质粒， 其特征在于， 所述重组反应的反应条 件为， 在冰水浴中建立反映体系， 采用吹打混匀， 离心后， 在37℃反应30min， 随后置于冰水 浴中冷却5mi n后立即转 化。 5.权利要求1所述的融合质粒在制备抗肺癌药物中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115109799 A 2一种小分子肽的融合质粒 及其在抗肿瘤药物中的应用 技术领域 [0001]本发明涉及 生物工程领域， 具体是一种小分子肽的融合质粒及 其在抗肿瘤药物中 的应用。 背景技术 [0002]枯草溶菌素转化酶9(Proprotein  Convertase  Subtilisin/Kexin  type 9， PCSK9)是Kexin样前转化 酶枯草杆菌蛋白酶家族的第9个成员， 在调节胆固醇代谢方面 发挥 重要功能。 近年来科学家还发现PCSK9在某些肿瘤中表达水平升高并促进肿瘤进展， 例如 PCSK9可促进神经胶质瘤、 肺腺癌和黑色素瘤的癌细胞增殖。 在这里 我们发现PCSK9在肝癌 中表达水平升高并导 致患者生存期缩短， 这说明PCSK9与肝癌的进 展密切相关。 [0003]通过测定肝癌细胞系SKHep1对九种药物的半数致死浓度(IC50)发现沉默PCSK9表 达显著改善肝癌细胞对肝癌化疗一线药物——索拉菲尼的敏感性。 PCSK9表达在耐索拉菲 尼的肝癌细胞SKHep1 ‑SR中升高， 在SKHep1 ‑SR中分别沉默和过表达PCSK9后， 通过其对索拉 菲尼IC50的变化， 显示PCSK9增强了SKHep1 ‑SR对索拉菲尼的抗性。 细胞增殖 实验、 平板克隆 以及细胞凋亡流式检测也 都说明降低P CSK9的表达可改善SKHep1 ‑SR对索拉菲尼的敏感性。 在小鼠皮下瘤模型中同样印证了索拉菲尼显著抑制了低PCSK9水平小鼠的肝癌进展。 综上 所述， PCSK9促进了肝癌的进 展并导致肝癌细胞对索拉菲尼不敏感。 发明内容 [0004]本发明的目的在于提供一种小分子肽的融合质粒及其在 抗肿瘤药物中的应用， 它 能够和PCSK9竞争发生棕榈酰 化修饰并且 恢复PTEN的表达 。 [0005]本发明为实现上述目的， 通过以下技 术方案实现： [0006]一种小分子肽的融合质粒， 通过以下 方法获得： [0007]对GFP利用限制性内切酶消化获得线性 化载体； [0008]基于PCSK9第593 ‑618位的氨基酸使用PCR扩增获得目的基因片段； [0009]以线性化载体和目的基因扩增产物配制反应体系， 进行重组反应， 实现线性化载 体和目的基因片段的体外环化并获得重组产物； [0010]提纯得高纯度质粒。 [0011]所述PCR扩增的引物序列为： [0012]ACGGGCCCTCTAGACTCGAGCGC CACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG。 [0013]所述PCR扩增引物在其5 ’端添加同源重组序列， 使用该引物扩增目的基因片段， 扩 增产物5’和3’最末端的序列分别不线性 化克隆载体两末端序列完全一 致。 [0014]所述重组反应 的反应条件为， 在冰水浴中建立反映体系， 采用吹打混匀， 离心后， 在37℃反应3 0min， 随后置 于冰水浴中冷却5mi n后立即转 化。 [0015]上述融合质粒在制备抗肺癌药物中的应用作为本发明的另一个方面。 [0016]对比现有技 术， 本发明的有益效果在于：说　明　书 1/7 页 3 CN 115109799 A 3