(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211211385.7 (22)申请日 2022.09.30 (71)申请人 北京奇迈 永华生物科技有限公司 地址 100176 北京市大兴区经济技 术开发 区经海四路25号院2号楼1单元4层401 室 (72)发明人 刘永峰　芦志华　 (74)专利代理 机构 北京预立 生科知识产权代理 有限公司 1 1736 专利代理师 朱萍 (51)Int.Cl. C12N 15/867(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 15/62(2006.01) A61K 39/00(2006.01)A61P 35/02(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种慢病毒高效感 染人NK细胞的方法 (57)摘要 本发明属于生物医药领域， 具体是一种慢病 毒高效感染人NK细胞的方法。 所述方法包括使用 携带目标基因的病毒对NK细胞进行两次病毒感 染的步骤， 第一次病毒感染时加入pol ybrene， 第 二次病毒感染时加入PMA、 IONOMYCIN、 polybrene、 I L‑2。 权利要求书3页 说明书5页 附图2页 CN 115505600 A 2022.12.23 CN 115505600 A 1.一种将目标基因导入NK细胞的方法， 所述方法包括使用携带目标基因的病 毒对NK细 胞进行两次病毒感染的步骤， 第一次病毒感染时加入polybrene， 第二次病毒感染时加入 PMA、 IONOM YCIN、 polybrene、 I L‑2； 优选地， 所述po lybrene的工作浓度是8 μg/ml； 优选地， 所述PMA的工作浓度是1 μg/ml； 优选地， 所述 IONOMYCIN的工作浓度是0.25 μg/ml； 优选地， 所述 IL‑2的工作浓度是15 0ng/ml。 2.如权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 所述病毒是慢病毒； 优选地， 所述第一次病毒感染时的病毒复数是3 ‑5MOI； 最优选地， 所述第一次病毒感染 时的病毒复数 是4MOI； 优选地， 所述第二次病毒感染时的病毒复数是5 ‑7MOI； 最优选地， 所述第二次病毒感染 时的病毒复数 是6MOI； 优选地， 所述第一次病毒感染的持续时间是1 ‑3小时； 最优选地， 2小时； 优选地， 所述第二次病毒感染的持续时间是3 ‑5小时； 最优选地， 4小时。 3.如权利要求1所述的方法， 所述目标基因包括嵌合 抗原受体。 4.如权利要求1所述的方法， 所述NK细胞是由自行制备的人源NK细胞或是商品化的NK 细胞系； 优选地， 所述 NK细胞系包括 NK‑92、 NKG、 YT、 NK ‑YS、 HANK‑1； 优选地， 所述 NK细胞是自体细胞或异体细胞； 优选地， 所述 NK细胞是由干细胞诱 导分化得到的， 或者自脐带 血或外周血分离得到的； 优选地， 所述NK细胞的制备方法包括制备单个核细胞的步骤、 诱导NK细胞的步骤、 收集 细胞的步骤； 优选地， 所述单个核细胞包括外周血 单个核细胞和脐带 血单个核细胞； 优选地， 所述单个核细胞 是外周血 单个核细胞； 优选地， 所述干细 胞包括ESC、 iPSC、 拟胚体、 细胞造血干细胞、 神经干细胞、 间充质干细 胞、 皮肤干细胞、 脂肪干细胞、 脐血干细胞中的一种或多种。 5.一种病 毒感染NK细胞的培养系统， 所述培养系统包括第 一病毒感染单元和第 二病毒 感染单元， 所述第一病毒感染单元中向病毒感染体系中加入polybrene， 所述第二病毒感染 单元中向病毒感染体系中加入PMA、 IONOM YCIN、 polybrene、 I L‑2； 优选地， 所述po lybrene的工作浓度是8 μg/ml； 优选地， 所述PMA的工作浓度是1 μg/ml； 优选地， 所述 IONOMYCIN的工作浓度是0.25 μg/ml； 优选地， 所述 IL‑2的工作浓度是15 0ng/ml。 6.如权利要求5所述的培 养系统， 所述培 养系统包括以下 单元： 1)慢病毒制备 单元， 2)NK细胞收集或制备 单元， 3)第一病毒感染单 元， 4)第二病毒感染单 元； 优选地， 所述培 养系统还可以包括 NK细胞扩增培 养单元；权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115505600 A 2优选地， 所述培 养系统还可以包括 NK细胞阳性率质检单 元； 优选地， 所述培 养系统还可以包括 NK细胞杀伤活力质检单 元； 优选地， 所述慢病毒的载体包括pLK0.1 ‑puro、 pLK0.1 ‑CMV‑tGFP、 pLKO.1 ‑puro‑CMV‑ tGFP、 pLK0.1 ‑CMV‑Neo、 pLK0.1 ‑Neo、 pLKO.1 ‑Neo‑CMV‑tGFP、 pLKO.1 ‑puro‑CMV‑TagCFP、 pLKO.1‑puro‑CMV‑TagYFP、 pLKO.l ‑puro‑CMV‑TagRFP、 pLKO.1 ‑puro‑CMV‑TagFP635、 pLKO. ‑ puro‑UbC‑TurboGFP、 pLKO.l ‑puro‑UbC‑TagFP635、 pLKO ‑puro‑IPTG‑1xLacO、 pLKO ‑puro‑ IPTG‑3xLacO、 pLPl、 pLP2、 pLP/VSV ‑G、 pENTR/U6、 pLenti6/BLOCK ‑iT‑DEST、 pLenti6 ‑GW/U6‑ laminshrn； 优选地， 所述对慢病毒 进行包装可以使用人类细胞株或非人细胞株； 优选地， 所述 NK细胞包括由自行制备的人源NK细胞或是商品化的NK细胞系； 优选地， 所述 NK细胞系包括 NK‑92、 NKG、 YT、 NK ‑YS、 HANK‑1； 优选地， 所述 NK细胞是自体细胞或异体细胞； 优选地， 所述 NK细胞是由干细胞诱 导分化得到的， 或者自脐带 血或外周血分离得到的； 优选地， 所述NK细胞的制备方法包括制备单个核细胞的步骤、 诱导NK细胞的步骤、 收集 细胞的步骤； 优选地， 所述单个核细胞包括外周血 单个核细胞和脐带 血单个核细胞； 优选地， 所述单个核细胞 是外周血 单个核细胞； 优选地， 所述干细 胞包括ESC、 iPSC、 拟胚体、 细胞造血干细胞、 神经干细胞、 间充质干细 胞、 皮肤干细胞、 脂肪干细胞、 脐血干细胞中的一种或多种。 7.权利要求5所述的培 养系统在制备含有目标基因的NK细胞中的用途； 优选地， 所述目标基因包括嵌合 抗原受体； 优选地， 所述 NK细胞包括由自行制备的人源NK细胞或是商品化的NK细胞系； 优选地， 所述 NK细胞系包括 NK‑92、 NKG、 YT、 NK ‑YS、 HANK‑1； 优选地， 所述 NK细胞是自体细胞或异体细胞； 优选地， 所述 NK细胞是由干细胞诱 导分化得到的， 或者自脐带 血或外周血分离得到的； 优选地， 所述NK细胞的制备方法包括制备单个核细胞的步骤、 诱导NK细胞的步骤、 收集 细胞的步骤； 优选地， 所述单个核细胞包括外周血 单个核细胞和脐带 血单个核细胞； 优选地， 所述单个核细胞 是外周血 单个核细胞； 优选地， 所述干细 胞包括ESC、 iPSC、 拟胚体、 细胞造血干细胞、 神经干细胞、 间充质干细 胞、 皮肤干细胞、 脂肪干细胞、 脐血干细胞中的一种或多种。 8.权利要求5所述的培养系统在提高将目标基因高效转入NK细胞中的转入 效率中的用 途； 优选地， 所述目标基因包括嵌合 抗原受体； 优选地， 所述 NK细胞包括由自行制备的人源NK细胞或是商品化的NK细胞系； 优选地， 所述 NK细胞系包括 NK‑92、 NKG、 YT、 NK ‑YS、 HANK‑1； 优选地， 所述 NK细胞是自体细胞或异体细胞； 优选地， 所述 NK细胞是由干细胞诱 导分化得到的， 或者自脐带 血或外周血分离得到的； 优选地， 所述NK细胞的制备方法包括制备单个核细胞的步骤、 诱导NK细胞的步骤、 收集权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 115505600 A 3