(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211018550.7 (22)申请日 2022.08.24 (71)申请人 桂林医学院 地址 541199 广西壮 族自治区桂林市临桂 区致远路1号 (72)发明人 欧叶涛　欧明坤　石雅倩　黄思源　 李鑫　 (74)专利代理 机构 北京国坤专利代理事务所 (普通合伙) 11491 专利代理师 赵红霞 (51)Int.Cl. C07K 19/00(2006.01) C07K 16/28(2006.01) A61K 38/17(2006.01) A61P 35/00(2006.01)G01N 33/68(2006.01) G01N 21/64(2006.01) C09K 11/06(2006.01) (54)发明名称 一种新的G蛋白偶联受体蛋白及其用途 (57)摘要 本发明属于生物大分子技术领域， 公开了一 种新的G蛋白偶联受体蛋白及其用途， 本发明采 用。 本发明通过制备G蛋白偶联受体的抗体方法 制备的抗体可同时识别同源性相近的G蛋白偶联 受体， 使用该抗体生产的G蛋白偶联受体试剂盒 针对细胞水平G蛋白偶联受体信号快速检测； 同 时， 通过基于G蛋白偶联受体构建的荧光探针方 法利用本发明的荧光探针和方法， 可以实现对G 蛋白偶联受体的特异性配体的高效、 准确的检 测， 有较高的时间分辨率， 可以实时追踪G蛋白偶 联受体的特异性配 体在特定环境中的动态变化。 权利要求书2页 说明书5页 附图1页 CN 115477706 A 2022.12.16 CN 115477706 A 1.一种新的G蛋白偶联受体蛋白， 其特征在于， 所述新的G蛋白偶联受体蛋白制备方法 包括以下步骤： 步骤一， 在G蛋白偶联受体的N ‑末端、 C‑末端或膜内环区3插入真核细胞蛋白， 获得G蛋 白偶联受体蛋白； 所述G蛋白偶联受体为腺苷 A2a蛋白； 所述真核细胞蛋白选自APC蛋白片段或与该片段序列同源性大于90％的蛋白。 2.一种如权利要求1所述新的G蛋白偶联受体 蛋白的用途， 其特征在于， 所述新的G蛋白 偶联受体蛋白的用途： (1)用于制备G蛋白偶联受体的抗体； (2)用于基于G蛋白偶联受体构建的荧 光探针； (3)制备用于治疗或预防癌症的药物。 3.如权利要求1所述新的G蛋白偶联受体 蛋白的用途， 其特征在于， 所述制备G蛋白偶联 受体的抗体方法如下： (1.1)选择多个多肽免疫原作为同源性相近的两个或 以上G蛋白偶联受体蛋白的抗原 多肽组， 修饰各多肽免疫原， 纯化， 得到抗原决定 簇多肽； (1.2)将质量比为2： 9： 1的抗原决定簇多肽、 血蓝蛋白和Sulfo ‑SMCC偶联， 纯化， 加入弗 氏佐剂进行乳化， 形成全抗原； 抗原决定 簇多肽和血蓝蛋白的质量比为1:1； (1.3)将所述全抗原采用多克隆抗体技术制备抗血清； 将抗血清进行预处理后， 与 抗原 决定簇多肽、 偶联树脂进行拌样混合后装入层析柱， 采用pH3.0的甘氨酸缓冲液作为洗脱 液， 收集洗脱液， 得到抗体。 4.如权利要求1所述新的G蛋白偶联受体 蛋白的用途， 其特征在于， 所述基于G蛋白偶联 受体构建的荧 光探针方法如下： (2.1)荧光探针是对G蛋白偶联受体蛋白进行改造获得的融合蛋白； (2.2)在G蛋白偶联受体蛋白的第五跨膜区和第六跨膜区之间的第三胞内环中插入循 环重排的荧 光蛋白； 所述基于G蛋白偶联受体 蛋白构建的荧光探针能够在细胞膜上表达； 并且所述基于G蛋 白偶联受体蛋白构建的的荧光探针当与所述G蛋白偶联 受体蛋白的特异 性配体接触时可以 与其结合， 由此导 致荧光探针的荧 光强度具有可检测到的变化。 5.如权利要求4所述新的G蛋白偶联受体 蛋白的用途， 其特征在于， 所述改造包括对G蛋 白偶联受体蛋白的第五跨膜区和第六跨膜区之间的第三胞内环截短并在截短的位置插入 循环重排的荧 光蛋白。 6.如权利要求5所述新的G蛋白偶联受体蛋白的用途， 其特征在于， 所述循环重排的荧 光蛋白两端分别通过 连接肽与G蛋白偶联受体蛋白的第三胞内环相连。 7.如权利要求6所述新的G蛋白偶联受体蛋白的用途， 其特征在于， 所述连接肽包括柔 性氨基酸； 所述 柔性氨基酸包括甘 氨酸和/或丙氨酸。 8.如权利要求7所述新的G蛋白偶联受体蛋白及其用途， 其特征在于， 所述连接肽由甘 氨酸和丙氨酸组成。 9.如权利要求6所述新的G蛋白偶联受体蛋白的用途， 其特征在于， 所述循环重排的荧 光蛋白N端的连接肽为G G， 和/或循环重排的荧 光蛋白C端的连接肽为G GAAA；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115477706 A 2所述循环重排的荧光蛋白选自循环重排的绿色荧光蛋白(cpGFP)、 循环重排的黄色荧 光蛋白(cpYFP)、 循环重排的红色荧光蛋 白(cpRFP)、 循环重排的蓝色荧光蛋白(cpBFP)、 循 环重排的增强绿色荧光蛋白(cpEGFP)、 循环重排的增强黄色荧光蛋白(cpEYFP)和循环重排 的红外荧 光蛋白(cpiRFP)； 所述循环重排的增强绿色荧 光蛋白优选是来自GCaMP6s、 GCaMP6m或G ‑GECO的cpEGFP； 所述循环重排的红色荧光蛋白是cpmApple、 cpmCherry、 cpmRuby2、 cpmKate2和 cpFushionRed； 所述cpmApple是来自R ‑GECO1的cpmApple； 优选地， 所述循环重排的黄色荧光蛋白包括 但不限于循环重排的Venus(cpVenus)、 循环重排的Cit rin(cpCitrine)。 10.如权利要求2所述新的G蛋白偶联受体蛋白的用途， 其特征在于， 所述用途还包括： 乳腺癌细胞gpr35通过激活mTOR信号通路， 增加trap1蛋白的表达， 引起乳腺癌细胞线粒体 功能损伤， 促进肿瘤的发生发展， 为临床gpr3 5为靶点的乳腺癌生物学治疗提供新的思路。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115477706 A 3