ICS 67.050 X 04 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T20765—2006 猪肝脏、肾脏、肌肉组织中维吉尼霉素M 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Method for determination of virginiamycin M residue in porcine liver, kidney and muscle tissues- LC-MS-MS method 2006-12-31发布 2007-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T20765—2006 前言 本标准的附录A和附录B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局提出。 本标准由中华人民共和国质量监督检验检疫总局归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：庞国芳、李一尘、宋文斌、董振霖、李军、隋凯、姜莉 本标准系首次发布的国家标准。 1 GB/T20765—2006 猪肝脏、肾脏、肌肉组织中维吉尼霉素M 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了猪肝脏、肾脏和肌肉组织中维吉尼霉素M残留量液相色谱-串联质谱测定方法。 本标准适用于猪肝脏、肾脏和肌肉组织中维吉尼霉素M残留量的测定。 本标准的方法检出限为：猪肝脏、肾脏和肌肉组织中维吉尼霉素Mi为0.25μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 (GB/T6379.1—2004,ISO5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测定方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004ISO5725-2:1994,IDT） GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—1992，neqISO3696：1987） 3原理 试样中残留的维吉尼霉素M，在甲醇十乙腈中匀浆提取、离心、取上清液用磷酸二氢铵缓冲溶液稀 释，于C1s固相萃取柱进行净化。将洗脱液中的维吉尼霉素M用三氯甲烷分离萃取，去除水层。氮吹 三氯甲烷至干，用甲酸铵缓冲溶液与甲醇混合液溶解并定容，供液相色谱-串联质谱仪测定 4试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1 乙酸。 4.2甲酸：色谱纯。 4.3甲醇：色谱纯。 4.4乙腈：色谱纯。 4.5 三氯甲烷：色谱纯。 4.6 磷酸二氢铵：优级纯。 4.7 甲酸铵：优级纯。 4.8磷酸二氢铵溶液：0.1mol/L，称取11.50g磷酸二氢铵（4.6），用水溶解定容至1000mL。 4.9磷酸二氢铵溶液：0.01mol/L，称取0.1mol/L磷酸二氢铵溶液（4.8)100mL，用水稀释定容至 1 000 mL 4.10甲酸铵缓冲液：0.12mol/L，pH=3.2,称取7.56g甲酸铵（4.7)用水溶解，用甲酸（4.2）调节 pH到3.2,定容至1000mL。 4.11甲酸铵缓冲液：0.003mol/L，pH=3.2,称取25.0mL的甲酸铵缓冲液（4.10），用水稀释定容至 GB/T20765—2006 1 000 mL. 2甲醇+乙溶液（50+50）。 4. 12 4. 13 3水+乙腈溶液（80+20）。 4.14水+甲醇溶液（65+35）。 4. 15 5水+甲醇溶液（45+55）。 4. 16 流动相A：0.003mol/L甲酸铵缓冲液（4.11)用0.22μm滤膜过滤。 流动相B甲醇+乙腈（50+50）（4.12)用0.22um滤膜过滤。 4. 17 标准物质：维吉尼霉素M，纯度95%。 4. 18 3标准储备溶液：0.1mg/mL。准确称取适量的维吉尼霉素M标准物质，用甲醇配成0.1mg/mL 的标准储备溶液。该溶液在4℃保存 注：称取标准物的质量是按纯度修正过的质量， 4.19标准工作溶液：根据维吉尼霉素M的灵敏度和仪器线性范围，用空白样品提取液配成不同浓度 的标准工作溶液。标准工作溶液在4℃保存。 5仪器 5.1液相色谱-串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源。 5.2离心机：最大转速为10000r/min。 5.3离心管：锥形底玻璃离心管40mL、15mL和10mL，具塞；锥形底聚丙烯离心管50mL，具螺 旋盖。 5.4电子天平：感量0.1mg和0.1g。 5.5过滤器：聚四氟乙烯膜过滤器：0.22μmX13mm；尼龙膜过滤器：0.22μmX47mm。 5.6移液器：量程为1mL~10mL和5mL~50mL。 5.7 微量加液器：量程为10uL～100μL，100μL～1000μL。 5. 8 高速分散匀质机。 5. 9 流动相过滤装置。 5. 10 氮气浓缩仪。 5.11 高速涡流混合器。 5. 12 振荡器。 5. 13 酸度计：测量精确度为土0.02。 5. 14 超声波仪。 5. 15 食物调理机。 5.16 一次性注射器：1mL。 5. 17 固相萃取柱：BondElutCis，500mg，柱长为6mL。 5.18 鸡心瓶：150mL。 5. 19 玻璃贮液器：100mL。 5.20 试样瓶：2mL。 5.21 一次性移液管。 6试样的制备与保存 6. 1 试样的制备 猪肝脏、肾脏要去除脂肪和其他的非肝脏、肾脏组织，猪肉要去皮和骨头。将其搅碎拌匀。分出 0.5kg作为试样，将制备好的试样密封，并做上标记 2 GB/T20765—2006 6.2试样保存 将试样置于一18℃条件下贮存。 7测定步骤 7.1提取 称取试样5.00g（精确到0.01g）放入50mL聚丙烯离心管中，加入10mL的甲醇十乙溶液 ） 15min（4000r/min），将上清液转移至40mL的洁净离心管中。再向残渣中加人2mL甲醇+乙溶 液（50+50）匀浆30s，依上述条件清洗匀浆头。高速振荡5min，离心10min（4000r/min）。合并两次 上清液于40mL离心管中。加人15mL的0.01mol/L磷酸二氢铵溶液（4.9），高速振荡5min，离心 10min（4000r/min）。将上清液转移至150mL的鸡心瓶中，加人80mL磷酸二氢铵溶液（4.9）混匀待 净化。 7.2净化 依次用5mL乙、5mL水和5mL的磷酸二氢铵溶液（4.9）洗涤活化固相萃取柱（5.17）。在柱上 装上玻璃贮液器（5.19），将样液（7.1)过柱，移去玻璃贮存器（5.19）。依次用2mL水，10mL水十乙睛 溶液（80十20），2mL水和水十甲醇溶液（65十35）洗柱，弃去全部流出液。最后用5mL水十甲醇溶液 （45十55）洗涤维吉尼霉素Ml，收集洗脱液到15mL的玻璃离心管中。将10mL三氯甲烷（4.5）加人洗 脱液中，振荡5min，离心10min（4000r/min）。用一次性移液管定量收集三氯甲烷层到10mL离心管 中，在40℃条件下氮吹至干。再向离心管中加入500μL甲醇，超声5min，加人500μL甲酸铵缓冲液 （4.11），高速涡旋5s。样液用0.22μm的滤膜过滤到样品瓶中，供液相色谱-串联质谱仪测定。 7.3色谱测定 7.3.1液相色谱条件 色谱柱：SunFireCis，5μm，150mmX2.1mm（内径）或相当者； a) b) 柱温：40℃； c) 进样量：30uL； d) 色谱柱总流量：300μL/min； 流动相及梯度见表1。 e) 表1流动相及梯度 时间/min 流动相A/（%） 流动相B/（%） 0. 00 93 7 20.00 40 60 26.00 40 60 28.00 93 7 SAC 35.00 93 7 7.3.2 质谱条件 a) 离子源：电喷雾离子源； b) 扫描方式：正离子扫描； c) 检测方式：多反应检测； d) 电喷雾电压（IS)：5000V； e) 雾化气压力（CAS1：517.1kPa； f) 气帘气压力（CUR）：103.4kPa； g) 辅助气压力（CAS2）：620.5kPa；