ICS 65.120 B 46 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 21995—2008 饲料中硝基咪唑类药物的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of nitroimidazoles in feeds- Liquid chromatography-tandem mass spectrometry method 2008-06-17发布 2008-10-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T21995—2008 前言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：中国农业大学动物医学院。 本标准主要起草人：沈建忠、张素霞、程林丽、肖希龙、李晓薇、曹兴元、王战辉 GB/T21995—2008 饲料中硝基咪唑类药物的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了饲料中硝基咪唑类药物含量的液相色谱-串联质谱测定方法。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料中甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝唑和替硝唑含量的 测定。 本标准的检测限：饲料中甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝唑和替硝唑均为8μg/kg。 本标准的定量限：饲料中甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝唑和替硝唑均为25μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准， GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—1992，neqISO3696：1987） GB/T14699.1饲料采样 GB/T20195动物饲料试样的制备 3方法原理 用乙酸乙酯提取试样中的硝基咪唑类药物，浓缩至近干后，溶解于0.1mol/L磷酸中，经正已烷液 液分配和MCX固相萃取柱净化，用液相色谱-串联质谱法测定，以色谱保留时间和质谱碎片离子共同 定性，外标法定量。 4试剂和材料 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和GB/T6682中规定的二级水 4.1甲醇：色谱纯。 4.2 乙睛：色谱纯。 4.3 乙酸乙酯。 4.4磷酸。 4.5 正已烷。 4.6 甲酸：色谱纯。 4.7 MCX固相萃取柱：规格为60mg 4.8 微孔滤膜：规格为0.2μm。 4. 9 甲硝唑（metronidazole）：纯度≥98%。 4.10 洛硝哒唑（ronidazole）：纯度≥98%。 4. 11 二甲硝唑（dimetridazole）：纯度≥98%。 4. 12 替硝唑（tinidazole）：纯度≥98%。 4.13 磷酸溶液（0.1mol/L）：取3.4mL磷酸于1L容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。 4.14 固相萃取柱淋洗液：氨水十水十甲醇=0.2十10十0.2。 1 GB/T21995—2008 4.15固相萃取柱洗脱液：氨水十水十甲醇=0.2十2十8 4.16硝基咪唑类药物混合标准贮备液（1000μg/mL）：称取甲硝唑（4.9）、咯硝哒唑（4.10）、二甲硝唑 （4.11）和替硝唑（4.12)各0.1g（精确到0.0001g）于100mL容量瓶中，用乙腈溶解定容。一20℃可 保存3个月。 4.17硝基咪唑类药物混合标准贮备液（200μg/mL）：移取1000μg/mL硝基咪唑类药物混合标准贮 备液（4.16）10mL于50mL容量瓶中，用乙睛稀释定容。4C可保存1个月。 4.18标准工作液：移取适量200μg/mL硝基咪唑类药物混合标准贮备液（4.17），用乙睛稀释定容，配 制成0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10μg/mL的标准工作液。4℃可保存1周。 5仪器和设备 5.1实验室常用仪器、设备。 5.2液相色谱-串联质谱联用仪：配电喷雾离子源。 5.3分析天平：感量为0.01g和0.0001g。 5.4旋涡混合器。 5.5离心机。 5.6振荡器。 5.7旋转蒸发仪。 5.8固相萃取装置。 6采样与试样制备 按GB/T14699.1规定采集试样后，按GB/T20195规定，取有代表性的样品1kg，四分法缩减，取 约200g，经粉碎，全部过0.45mm孔筛，混匀装人磨口瓶中备用。 7分析步骤 7.1提取 称取2g（精确到0.01g）试样于50mL离心管中，加15mL乙酸乙酯，涡动1min，300r/min振荡 取一次。合并两次上清液，为样品提取液。 7.2净化 SIC 将样品提取液于35℃浓缩至近干。加300μL乙酸乙酯，涡动10s，再加4mL正已烷，涡动30s， 全部转移至10mL离心管中。往鸡心瓶中再加1.5mL磷酸溶液（4.13），涡动1min，全部转移至同一 离心管中。加盖密闭，手摇混合，6000r/min离心10min。吸取下层水相于5mL试管，上层有机相用 1.5mL磷酸溶液（4.13）重复萃取一次，合并两次水相作为固相萃取上样液。 将MCX固相萃取柱安装于固相萃取装置上，依次用2mL乙睛、2mL磷酸溶液（4.13）活化。将固 相萃取上样液加载到固相萃取柱上。依次用1mL磷酸溶液（4.13）、2mL固相萃取柱洗涤液（4.14）淋 洗，抽真空1min。用2mL固相萃取柱洗脱液（4.15）洗脱。上样溶液和洗脱液的流速均控制在不超过 1mL/min。往洗脱液中加20μL甲酸，混匀。50℃氮气吹干后，用2mL乙腈复溶，过0.2μm滤膜，供 液相色谱-串联质谱仪测定。 7.3测定 7.3.1液相色谱条件 色谱柱：C柱，长150mm，内径2.1mm，粒径5μm，或相当者。 2 GB/T21995—2008 流动相：甲醇十水，梯度洗脱，梯度洗脱条件见表1。 表1梯度洗脱条件 时间/min 水/% 甲醇/% 0.0 100 0 12 30 70 16 0 100 25 100 0 流速：0.2mL/min。 柱温：室温。 进样量：10μL。 7.3.2串联质谱条件 离子化模式：电喷雾电离，正离子扫描（ESI十）。 离子源喷雾电压：4.5kV。 离子源温度：80℃。 脱溶剂温度：300℃。 毛细管电压：3V。 碰撞气：氩气。 监测模式：多反应监测。 4种硝基咪唑类药物的定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量，见表2。 表24种硝基咪唑类药物的定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量 名 称 定性离子对(m/z) 定量离子对(m/z) 锥孔电压/V 碰撞能量/eV 201/140 11 洛硝哒唑 201/140 18 201/55 23 172/128 14 甲硝唑 172/128 22 172/82 23 142/96 16 二甲硝唑 142/96 25 142/81 25 248/120.7 17 替硝唑 248/120.7 20 248/92.7 17 7.3.3液相色谱-串联质谱测定 7.3.3.1定性测定 根据试样溶液中药物的含量，选择峰面积相近的标准工作液和样品溶液等体积参插进样。通过液 2.5%，而且其选择离子的相对丰度的差异不大于10%。4种药物的标准溶液选择离子色谱图参见 图A.1。 7. 3. 3. 2 定量测定 分别取适量试样溶液和相应浓度的标准工作液，作单点校准或多点校准，以色谱峰面积积分值定 量。标准工作液及试样液中药物的响应值均应在仪器检测的线性范围内，试样液进样过程中应参插标 准工作液，以便准确定量。 3