ICS 65.020.30 CCS B44 43 湖南省 地方 标准 DB 43/T 2816—2023 鱼类粘孢子虫检测方法 Detection methods of fish myxosporean 2023 - 11 - 09发布 2024 - 02 - 09实施 湖南省市场监督管理局 发布 DB 43/T 2816 —2023 I 目次 前言................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 试剂与材料 ........................................................................ 1 5 仪器与设备 ........................................................................ 1 6 采样 .............................................................................. 2 7 检查步骤 .......................................................................... 2 8 结果判定 .......................................................................... 3 附录A（规范性） 试剂及其配制 ........................................................ 4 附录B（资料性） 不同粘孢子虫感染症状及包囊形态 ...................................... 5 附录C（资料性） 几种常见粘孢子虫成熟孢子形态 ........................................ 6 DB 43/T 2816 —2023 II 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由湖南省农业农村厅提出。 本文件由湖南省农业标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：湖南 农业大学、湖南应用技术学院、资兴市水产良种场、中国科学院水生生物研 究所。 本文件主要起草人：刘新华、任诗思、皮杰、李德亮、向建国、余建波、吕欣荣、刘志辉、叶少文。 DB 43/T 2816 —2023 1 鱼类粘孢子虫检测方法 1 范围 本文件给出了湖泊鱼类粘孢子虫检测的试剂与材料、 仪器和设备、 采样、 检查步骤与结果判定方法。 本文件适用于鱼类粘孢子虫的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范 SC/T 7223.1 黏孢子虫病诊断规程 第1部分：洪湖碘泡虫 SC/T 7223.2 黏孢子虫病诊断规程 第2部分：吴李碘泡虫 SC/T 7223.3 黏孢子虫病诊断规程 第3部分：武汉单极虫 SC/T 7223.4 黏孢子虫病诊断规程 第4部分：吉陶单极虫 SN/T 2503 淡水鱼中寄生虫检疫技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 试剂与材料 本标准所使用的试剂均为分析纯，水为蒸馏水。 乙醇：70%乙醇。 溴酚蓝。 10xPCR Buffer MIX ：-20℃保存，避免反复冻融。 引物序列 上游引物： 5’-GAT TGA CGA GGT CGT TCG TTT A -3’； 下游引物： 5’-AGT AGG CCC TTA CCC TAC TTA C -3’； 本对引物扩增小核糖体小亚基 rRNA基因（18S rDNA）的部分序列。 DNA marker 2000 （bp）: 2000、1000 、750、500 、250、100。 5 仪器与设备 解剖盘、剪刀、镊子、解剖针、解剖刀。 体视显微镜和带测微标尺的光学显微镜。 盖玻片、载玻片、培养皿、巴氏吸管。 恒温水浴锅（控温范围： RT-100℃±1℃）。 DB 43/T 2816 —2023 2 -20℃和-80℃冰箱。 微量移液器（ 0.5 μL～10 μL，10 μL～100 μL，100 μL～1000 μL）。 PCR扩增仪。 离心管和 PCR管。 高压灭菌锅。 超净工作台。 水平电泳系统。 紫外透射仪或凝胶成像系统。 6 采样 样品的采集应符合 SC/T 7103、SC/T 7223.1、SC/T 7223.2 、SC/T 7223.3 和SC/T 7223.4 中的相 关要求，样品封存和运输应符合 SC/T 7103 的相关规定。 7 检查步骤 目检 观察样品，检查顺序应符合 SN/T 2503中的相关要求，先检查体表部位是否有明显的白色包囊或似 包囊状瘤状物，如体表皮肤、鳍、鼻腔、口腔、眼球等，随后解剖鱼体观察内脏是否出现白色包囊，包 括体腔、脂肪组织、胃肠 、肝、脾等。 镜检 7.2.1 当在7.1中发现疑似包囊状物时， 用剪刀与镊子将单个或多个包囊分离， 置于载玻片上。 然后， 再用解剖针戳破疑似包囊物，加入约 20 μL -30 μL双蒸水，盖上盖玻片置于光学显微镜中观察是否 存在成熟孢子。 7.2.2 当在鱼体组织中未发现疑似包囊状物时，用剪刀或镊子取少量组织或液体（胆汁、血液、尿液 等）置于载玻片上，用镊子将组织分散，加入约 20 μL -30 μL双蒸水，盖上盖玻片，稍加压平，置 于光学显微镜中观察是否存在成熟孢子。 分子鉴定 7.3.1 检测样本固定 将6.2中粘孢子虫感染的包囊或组织从宿主上分离，用浓度大于 70%的乙醇固定于离心管中（参见 附录A），低温（- 20℃）保存，标识好标签并记录。 7.3.2 DNA提取 将6.2固定的样品充分混匀， 破碎后用磷酸盐缓冲液洗涤两次以去除残余酒精。 将离心管置于- 80℃ 冰箱快速冷冻 5 min，取出并立即置于 80℃水浴锅中 5 min，重复三次后镜检观察孢子是否完全破碎， 极丝是否挤出。破碎后利用细胞 /组织基因组 DNA提取试剂盒，提取样品基因组 DNA。提取好的基因组 DNA置于-20℃保存备用。 7.3.3 PCR扩增