ICS 11.220 B 41 天 DB12 津 市 地 方 标 准 DB12/T 521—2014 牛结核病噬菌体检测技术规范 The Technical Standard for Detection of Bovine Tuberculosis by Mycobacteriophage 2014-04-22 发布 2014-07-20 实施 天津市质量 技术监督局 发布 DB12/T 521—2014 前 言 本标准的编写符合 GB/T1.1-2009 的要求。 本标准由天津市畜牧兽医局提出。 本标准由天津市动物卫生监督所起草。 本标准主要起草人：刘子芝、赵勇、李志荣、刘纪艳、尹望中、杨建华、周永燚、王颖、赵晶。 本标准于2014年4月发布。 I DB12/T 521—2014 牛结核病噬菌体检测技术规范 1 范围 本标准规定了噬菌体生物扩增技术检测牛结核病的定义、设备和仪器、培养基和试剂、检测、结果 判定、注意事项。 本标准适用于牛结核病的疫病普查、监测和诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 541 动物疫病实验室检验采样方法 3 定义 3.1 噬菌体 Bacteriophage,简称 phage 噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，因部分能引起宿主菌的裂解， 故称为噬菌体。 3.2 噬菌斑 plaque 在人工培养基上，细菌在噬菌体的作用下裂解形成的圆形斑，称为噬菌斑。 4 设备和仪器 a 生物安全柜 b 离心机（4000 r/min） c 振荡器 d 水浴锅（55 ℃） e 恒温培养箱 f 有盖离心管（50 mL） g 无菌试管（10 mL） h 移液管（10 mL） i 三角瓶（100 mL，500 mL） j 平皿（90 mm） k 移液器及配套吸头（100 μL，1000 μL） 5 培养基和试剂 培养基和试剂配制方法见附录 A 6 6.1 检测 样本的采集 1 DB××/T ×××—×××× 按照NY/T 541 进行样本采集。 6.2 样本的处理 6.2.1 牛乳 取牛乳 5 mL 于 50 mL 有盖离心管中，加 10 mL 的 3%NaoH 溶液；振荡混匀，室温孵育 15 min； 加灭菌完全培养基至 30 mL，4000 r/min 离心 15 min，弃去上清液；再加灭菌完全培养基至 30 mL，4000 r/min 离心 15 min 后弃去上清液；加 1 mL 灭菌完全培养基重悬沉淀物，无菌条件下转移至 10 mL 无菌 试管中。 6.2.2 口鼻分泌物 取2 mL牛口鼻分泌物（或2 mL保存液中的牛口鼻分泌物棉拭子样品）于50 mL有盖离心管中，处理 方法同6.2.1。 6.3 检测 6.3.1 阴性对照：吸取1 mL灭菌完全培养基于10 mL无菌试管中，为“阴性对照”。 6.3.2 阳性对照：取50 μL指示细胞溶液用灭菌完全培养基稀释至1.0×106 cfu/mL，取1 mL稀释后的溶 液于10 mL无菌试管中，为“阳性对照” 。 6.3.3 灭菌双蒸水空白对照：灭菌双蒸水处理方法同 6.2.1。 6.3.4 在阳性对照、阴性对照、空白对照及样本管中分别加入100 μL噬菌体D29溶液，混匀，于37 ℃水 浴锅中孵育2 h； 6.3.5 上述反应管中分别加100 μL杀病毒剂，充分混匀，置于室温10 min； 6.3.6 上述反应管中分别加8 mL完全培养基，混匀； 6.3.7 上述反应管中分别加1 mL指示细胞溶液，混匀； 6.3.8 快速将反应管中所有的内容物分别倒入相应的空的90 mm的无菌平皿中；立即加8 mL冷却至55 ℃左右的琼脂培养基于各平皿中，快速混匀，置于室温定型； 6.3.9 将平皿倒置于37℃培养箱中培养，18 h~24 h后判读结果。 7 结果判定 当阳性对照平皿中噬菌斑数目≥20个，阴性对照平皿的噬菌斑数少于10个，同时无菌双蒸水空白对 照均无噬菌斑时，试验成立。受检样品平皿中出现大小不等的噬菌斑且≥20个噬菌斑，或许多噬菌斑相 互融合成透明状判定为阳性；平皿中无噬菌斑出现或噬菌斑数量＜20个判定为阴性。 8 注意事项 8.1 试验前需将所有试剂和样本回复至室温。 8.2 加入杀毒剂后一定要彻底摇匀，以杀死全部未进入菌体里的噬菌体。 8.3 由于临床样本中可能含有病原体，因此所有操作过程应符合相关生物安全操作规程，如不得用口直 接接触移液器，正确使用手套、生物安全罩衣、口罩等相应的安全防护设施。 8.4 检测结束后，实验用品和废弃物，应进行高温高压或其他生物安全处理。 2 DB12/T 521—2014 附 录 A （规范性附录） 培养基和试剂配制方法 A.1 Middlebrook7H9 基础培养基 将Middlebrook7H9基础培养基（自购）4.7 g加入900 mL蒸馏水（或去离子水）中，充分混匀，溶 解，121℃灭菌10 min，冷却至室温后使用。置于25℃下贮存，有效期4周。如该溶液污染（浑浊），则 弃用。 A.2 完全培养基 无菌条件下，将小牛血清复合物20 mL加至无菌已冷却的180 mL7H9基础培养基中，制得完全培养基。 4℃保存备用，有效期4周。如该溶液污染（浑浊），则弃用。 A.3 3% NaoH溶液 取NaoH 30 g，溶于1000 mL蒸馏水中，121℃灭菌10 min，冷却后备用。 A.4 噬菌体D29溶液 8 自购，用无菌完全培养基将噬菌体D29调至工作浓度为1.0×10 Pfu/mL，4℃保存备用。 A.5 指示细胞溶液 6 耻垢分枝杆菌（ATCC， 607， 自购），用无菌完全培养基将指示细胞配制成浓度为1.0×10 cfu /mL， 4℃保存备用。 A.6 杀病毒剂 将50 mL浓硫酸加入到800 mL蒸馏水中，冷却后再溶入40 g硫酸亚铁铵。在容量瓶中稀释到1000 mL， 4℃保存备用。贮存过程中，该溶液可能褪色或产生沉淀，但不影响其使用。 A.7 琼脂培养基 将 1.5 g 琼脂培养基干粉加入 100 mL7H9 基础培养基中，充分混匀，加热溶解，121℃灭菌 10 min 冷却至 55℃左右时使用。置于 25℃条件下贮存，有效期 4 周。再次使用则需加热融化，重融次数不 得超过 3 次。 3 DB12/T×××—×××× DB××/T ×××—××××