中华人民共和国国家标准 GB4789.43—2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 微生物源酶制剂抗菌活性的测定 2016-12-23发布 2017-06-23实施 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 国家食品药品监督管理总局发布GB4789.43—2016 1 食品安全国家标准 食品微生物学检验 微生物源酶制剂抗菌活性的测定 1 范围 本标准规定了微生物源酶制剂抗菌活性的测定方法。 本标准适用于用微生物生产的酶制剂抗菌活性的测定。 2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下: 2.1 生物安全柜。 2.2 冰箱:2℃~5℃。 2.3 恒温培养箱:36℃±1℃。 2.4 恒温水浴箱:46℃±1℃。 2.5 天平:感量为0.1g。 2.6 振荡器。 2.7 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。 2.8 无菌培养皿:直径90mm。 2.9 无菌锥形瓶:容量250mL、500mL。 2.10 pH计或精密pH试纸。 2.11 无菌纸片:见A.8。 2.12 无菌镊子。 2.13 游标卡尺:刻度为0.1mm。 3 培养基和试剂 3.1 胰蛋白胨大豆琼脂(TryptoneSoyAgar,TSA):见A.1。 3.2 胰蛋白胨大豆肉汤(TryptoneSoyBroth,TSB):见A.2。 3.3 平板计数琼脂(PlateCountAgar):见A.3。 3.4 0.1mol/LHCl:见A.4。 3.5 无菌生理盐水:见A.5。 3.6 50.0μg/mL环丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)溶液:见A.6。 3.7 5.0μg/片环丙沙星纸片:见A.7。 4 试验菌株 4.1 金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC6538。GB4789.43—2016 2 4.2 大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)ATCC11229。 4.3 蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)ATCC2。 4.4 环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)ATCC4516。 4.5 化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)ATCC12344。 4.6 粘质沙雷菌(Serratiamarcescens)ATCC14041。 5 检验程序 微生物源酶制剂抗菌活性的测定检验程序见图1。 图1 微生物源酶制剂抗菌活性的测定检验程序 6 操作步骤 6.1 试验菌悬液原液制备 将金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、大肠埃希氏菌(ATCC11229)、蜡样芽孢杆菌(ATCC2)、环状芽 孢杆菌(ATCC4516)、化脓性链球菌(ATCC12344)、粘质沙雷菌(ATCC14041)冻存菌株分别接种于GB4789.43—2016 3 盛有5mLTSB的试管,置36℃±1℃培养18h~24h进行第一次传代培养,分别挑取第一次传代培 养液1~2环转种于5mLTSB肉汤,置36℃±1℃培养18h~24h进行二次传代培养,作为试验菌悬 液原液备用。 试验菌悬液原液纯度检测:分别挑取试验菌悬液原液各一环,划线接种于TSA平板,36℃±1℃ 培养20h~24h,观察纯度。 6.2 菌悬液原液浓度测定 6.2.1 菌悬液原液稀释 分别取6.1中制备的菌悬液原液依次进行十倍梯度稀释,蜡样芽孢杆菌和环状芽孢杆菌分别制成 10-4稀释液,金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、化脓性链球菌、粘质沙雷菌分别制成10-5稀释液。 6.2.2 培养计数 分别吸取6.2.1中制备好的各菌稀释液1mL于无菌平皿内,每个稀释度做两个平行,并用无菌生 理盐水作空白对照。向平皿中倾注冷却至46℃左右(可放置于46℃±1℃的恒温水浴箱中保温)的平 板计数琼脂15mL~20mL,并转动平皿使其混合均匀。待琼脂凝固后,将平板翻转,于36℃±1℃培 养24h后计数,各菌悬液原液中菌浓度均大于106CFU/mL时方可使用。 6.3 检测平板制备 倾注融化并冷却至46℃±1℃的TSA培养基15mL于无菌培养皿内,待其凝固后制成TSA平 板,备用。 将6.1中二次传代后的各菌培养物分别用冷却至46℃±1℃的TSA培养基按1∶10的比例稀释 (其中化脓性链球菌ATCC12344按1∶20的比例稀释),充分混匀后各取10mL至上述已制备好、于 46℃±1℃中保温的TSA平板内,轻轻摇动平板使菌液均匀铺平,待其凝固后制成检测平板,备用。 注:为防止含菌培养基遇到TSA后马上凝固,引起菌悬液铺板不均匀,菌悬液铺板前应事先将TSA平板置于46℃± 1℃条件下保温平衡10min。 6.4 酶制剂纸片的制备 准确称(移)取1.0g(mL)酶制剂于9mL无菌生理盐水中,充分混匀后制成10%的酶制剂溶液。 将无菌纸片放入无菌平皿内,在每张纸片上缓缓滴加100μL10%的酶制剂溶液,使其全部吸收,每种酶 制剂样品制备12张纸片。 6.5 贴纸片及培养 将6.4中制备的含待测酶制剂的纸片、含环丙沙星的阳性对照纸片(见A.7)和含100μL无菌生理 盐水的空白阴性对照纸片用无菌镊子分别置6.3中制备的检测平板上,每个平板贴2张纸片(2张含待 测酶制剂的纸片或2张含环丙沙星的纸片或2张空白纸片),两纸片圆点的间距大于32mm,每个标准 菌株分别设一阳性对照和一阴性对照平板。将平板正置于4℃±0.5℃冰箱内过夜(12h~16h)。第 二天转入36℃±1℃恒温培养箱中培养24h后,测定酶制剂样品、环丙沙星和阴性对照纸片形成的抑 菌圈。 7 抗菌活性结果报告 7.1 结果判定 若待测酶制剂对3种或3种以上受试微生物呈现出抗菌活性,即纸片周围出现清晰可见的抑菌圈