中华人民共和国国家标准 GB 5009.204 —2014 食品安全国家标准 食品中丙烯酰胺的测定 2014-12-01发布 2015-05-01实施 GB 5009.204 —2014 I 前 言 本标准代替 GB/T 5009. 204－2005 《食品中丙烯酰胺含量的测定方法气相色谱一质谱 （GC-MS）法》。 本标准与 GB/T 5009. 204－2005相比，主要变化如下： ——增加第一法 稳定性同位素稀释的液相色谱 -质谱 /质谱法； ——气相色谱 -质谱法将外标法改为稳定性同位素稀释法。GB 5009.204 —2014 1 食品安全国家标准 食品中丙烯酰胺的测定 1 范围 本标准规定了食品中丙烯酰胺的测定方法。 本标准适用于 热加工（如煎、炙烤 、焙烤等） 食品中丙烯酰胺的测定。 第一法 稳定性同位素稀释的液相色谱 -质谱/质谱法 2 原理 本标准应用稳定性同位素稀释技术，在试样中加入13C3标记的丙烯酰胺内标溶液，以水为提取溶剂， 经过固相萃取柱或 基质固相分散萃取净化后，以液相色谱 -质谱/质谱的多反应离子监测 (MRM)或选择反 应监测(SRM)进行检测， 内标法定量。 3 试剂和材料 注：除非另有说明， 本方法所用试剂均为分析纯，水 为GB/T 6682 规定的一级水。 3.1 试剂 3.1.1 甲酸 (HCOOH) ：色谱纯。 3.1.2 甲醇 (CH 3OH)：色谱纯。 3.1.3 正己烷 (n-C6H14)：分析纯，重蒸后使用。 3.1.4 乙酸乙酯 (CH 3COOC 2H5)：分析纯，重蒸后使用。 3.1.5 无水硫酸钠 (Na 2SO 4) ：400 ℃，烘烤 4 h。 3.1.6 硫酸铵 [(NH 4)2SO 4]。 3.1.7 硅藻土： ExtrelutTM 20或相当产品。 3.2 标准品 3.2.1 丙烯酰胺 (CH 2=CHCONH 2) 标准品（纯度 >99%）。 3.2.2 13C3-丙烯酰胺（13CH2=13CH13CONH 2）标准品（纯度 >98%）。 3.3 标准溶液的配制 3.3.1 丙烯酰胺标准溶液的配制 3.3.1.1 丙烯酰胺标准储备溶液 （1000 mg/L）：准确称取丙烯酰胺标准品，用甲醇溶解并定容，使丙 烯酰胺浓度为 1000 mg/L ，置﹣20 ℃冰箱中保存。 3.3.1.2 丙烯酰胺中间溶液 （100 mg/L ） ： 移取丙烯酰胺标准储备溶液 1 mL，加甲醇稀释至 10 mL， 使 丙烯酰胺浓度为 100 mg/L ，置﹣20 ℃冰箱中保存。 3.3.1.3 丙烯酰胺工作溶液 Ⅰ（10 mg/L）：移取丙烯酰胺中间溶液 1 mL，用 0.1% 甲酸溶液 稀释至GB 5009.204 —2014 2 10 mL，使丙烯酰胺浓度为 10 mg/L。临用时配制 。 3.3.1.4 丙烯酰胺工作溶液 Ⅱ（1 mg/L）：移取丙烯酰胺工作溶液 Ⅰ1 mL，用 0.1%甲酸溶液 稀释至 10 mL,，使丙烯酰胺浓度为 1 mg/L。临用时配制 。 3.3.2 13C3-丙烯酰胺内标溶液 3.3.2.1 13C3-丙烯酰胺内标储备溶液 （1000 mg/L ）：准确称取13C3-丙烯酰胺标准品，用甲醇溶解并 定容，使13C3-丙烯酰胺浓度为 1 000 mg/L ，置﹣20 ℃冰箱保存 。 3.3.2.2 内标工作溶液（ 10 mg/L） ：移取内标储备溶液 1 mL，用甲醇稀释至 100 mL，使13C3-丙烯酰 胺浓度为 10 mg/L，置﹣20 ℃冰箱保存。 3.3.3 标准曲线工作溶液 取6个10 mL容量瓶，分别移取 0.1 mL、0.5 mL、1 mL丙烯酰胺工作溶液 II（1 mg/L）和0.5 mL、 1 mL和3 mL丙烯酰胺工作溶液 I（10 mg/L）与内标工作溶液 （10 mg/L）0.1 mL，用 0.1%甲酸溶液稀 释至刻度。标准系列溶液中丙烯酰胺的浓度分别为 10 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、500 μg/L 、1000 μg/L、3000 μg/L ，内标浓度为 100 μg/L。临用时配制 。 4 仪器和设备 4.1 液相色谱 -质谱 /质谱联用仪 （LC-MS/MS）。 4.2 HLB 固相萃取柱 ：6 mL、200 mg，或相当产品 。 4.3 Bond Elut -Accucat 固相萃取柱 ：3 mL、200 mg，或相当产品。 4.4 组织粉碎机。 4.5 旋转蒸发仪。 4.6 氮气浓缩器。 4.7 振荡器。 4.8 玻璃层析柱：柱长 30 cm，柱内径 1.8 cm。 4.9 涡旋混合器。 4.10 超纯水装置。 4.11 分析天平：感量为 0.1 mg。 4.12 离心机：转速 ≤10000 r /m。 5 分析步骤 5.1 试样制备 5.1.1 样品提取 取50 g试样，经粉碎机粉碎， ﹣20℃冷冻保存。准确称取试样 1 g～2 g（精确到 0.001 g），加入 10 mg/L 13C3-丙烯酰胺内标工作溶液 10 μL（或 20 μL），相当于 100 ng（或 200 ng）的13C3-丙烯酰胺内标 ， 再加入超纯水 10 mL，振摇 30 min后，于 4000 r /m离心 10 min，取上清液待净化。 5.1.2 样品净化 注：任选下列一种方法进行净化。 5.1.2.1 基质固相分散萃取方法（选择 1） ：在试样提取的上清液中加入硫酸铵 15 g，振荡 10 min，使 其充分溶解，于 4000 r /m离心 10 min，取上清液 10 mL，备用。如上清液 不足 10 mL，则用饱和硫酸铵 补足。取洁净玻璃层析柱，在底部填少许玻璃棉并压紧，依次填装 10 g无水硫酸钠、 2 g硅藻土。称取 5 g 硅藻土 ExtrelutTM 20与上述试样上清液搅拌均匀后，装入层析柱中。用 70 mL正己烷淋洗，控制流