中华人民共和国国家标准 GB 5413.20 — 201 3 201 3 - 1 1 - 2 9 发布 201 4 - 0 6 - 0 1 实施 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定GB 5413.20 — 201 3 I 前 言 本标准代替 GB/T 5413.20 — 1997 《婴幼儿配方食品和乳粉 胆碱的测定》。 本标准与 GB/T 5413.20 — 1997 相比，主要变化如下： —— 修改了标准的名称； —— 修改 了用于酶反应的显色剂成分 ； —— 增加了第二法雷氏盐分光光度法。GB 5413.20 — 201 3 1 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定 1 范围 本标准规定了婴幼儿食品和乳品中 胆碱 的测定方法。 本标准 适用于 婴幼儿食品和乳 品 中胆碱的测定 。 第一法 酶比色法 2 原理 试样中的胆碱经酸水解后变成游离态的胆碱，再经酶氧化后与显色剂反应生成有色物质，其颜色 的深浅在一定浓度范围内与胆碱含量成正比。 3 试剂和材料 注 ： 除非另有 说明 ，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T6682 规定的三级水。 3.1 试剂 3.1.1 三羟甲基氨基甲烷 [(CH 2 OH) 3 CNH 2 ] 。 3.1.2 苯酚 (C 6 H 5 OH) 。 3.1.3 浓盐酸 (HCl) 。 3.1.4 氢氧化钠 (NaOH) 。 3.1.5 胆碱氧化酶： 置于 - 20 ℃ 保存。 3.1.6 过氧化物酶： 置于 2 ℃ ~ 8 ℃ 保存。 3.1.7 4- 氨基安替比林 (C 11 H 13 N 3 O) 。 3.1.8 磷脂酶 D ： 置于 - 20 ℃ 保存。 3.2 试剂配制 3.2.1 盐酸 ( 1 mol/L) ： 量取 85 mL 浓盐酸加水稀释至 1000 mL 。 3.2.2 盐酸 ( 3 mol/L ) ： 量取 125 mL 浓盐酸加水稀释至 500 mL 。 3.2.3 Tris 缓冲溶液 （ 0.05 mol/L ） ： pH = 8.0 ± 0.2 。 称取 6.057 g 三羟甲基氨基甲烷溶入 500 mL 蒸馏水中 ， 用 1 mol/L 盐酸调 pH 至 8.0 ± 0.2 ， 用蒸馏水定 容至 1000 mL 。此溶液在 4 ℃ 冰箱中可保存一个月。 3.2.4 用于酶反应的显色剂 ： 取 100 ~ 120 活力单位的胆碱氧化酶 、 250 ~ 280 活力单位的过氧化物酶 、 7 5 个 ~ 10 0 个活力单位的磷脂 酶 D 、 15 mg 4- 氨基安替比林 ， 50 m g 苯酚置 于 100 m L 的容量瓶中 ， 用 0.05 mol/L Tris 缓冲溶液稀释至刻度。 临用时 配 制 。 3.2.5 氢氧化钠溶液 (500 g/L) ：称取 500 g 氢氧化钠，溶于水并稀释至 1000 mL 。GB 5413.20 — 201 3 2 3.3 标准品 胆碱酒石酸氢盐标准品（ C 9 H 19 NO 7 ）： 纯度 ≥ 99% 。 3.4 标准溶液配制 3.4.1 胆碱氢氧化物标准贮备 溶 液 （ 2.5 mg/mL ） ： 称取在 102 ℃ ± 2 ℃ 烘至恒重的胆碱酒石酸氢盐 523 mg 置于 100 mL 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。冷藏于 4 ℃ ± 2 ℃ 冰箱中，保存不超过 1 周 。 3.4.2 胆碱氢氧化物标准工作 溶 液 （ 250 µ g/mL ） ： 吸取 10.0 mL 标准贮备 溶 液于 100 mL 容量瓶中 ， 用水稀释至刻度。 临用时配制 。 4 仪器和设备 4.1 天平：感量 为 0.01 g 和 0.1 mg 。 4.2 恒温水浴锅：温度可控制在 70 ℃ ± 2 ℃ 和 37 ℃ ± 2 ℃ 。 4.3 pH 计：精度 0.01 。 4.4 分光光度计。 5 分析步骤 5.1 试样制备 5.1.1 固体试样 称取 5 g （ 精确到 0.01 g ） 混合均匀的试样 ， 于 10 0 mL 的 锥形瓶 中 ， 加入 30 mL 盐酸 溶液 （ 3 . 2.1 ） 。 5.1.2 液体试样 称取 20 g （ 精确到 0.01 g ） 混合均匀的试样 ， 于 100 mL 的 锥形瓶 中 ， 加入 10 mL 盐酸溶液 （ 3 .2.2 ） 。 5.1.3 水解 将装有试样的容器放在 70 ℃ 水浴中 ， 加塞混匀 ， 水解 3 h （ 每隔 30 min 振摇一次 ） ， 冷却 。 用氢 氧化钠溶液调 pH 为 3.5 ～ 4.0 ，转入 50 mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。 5.1.4 过滤 过滤水解液 （ 5 .1.3 ） 。 滤液应是澄清的 ， 否则 ， 用 0.45 μ m 的滤膜再次过滤 。 滤液放在 4 ℃ 的冰箱 中可以保存 3 d 。 5.2 测定 5.2.1 标 准曲线的 制作 分别吸取 2 mL 、 4 mL 、 6 mL 、 8 mL 胆碱氢氧化物标准工作 溶 液 于 10 mL 的容量瓶 中 ， 用蒸馏水稀 释至刻度。准备 6 支试管，一个试管用作试剂空白（ A ） ， 另五支试管由 1 至 5 编号，分别用于标准溶液 和标准溶液的四个稀释度。按表 1 加入试剂。