ICS 11.220 B 41 DB51 四 川 省 地 方 标 准 DB51/T 1419—2012 大熊猫须癣毛癣菌病检疫技术规范 2012 - 03 - 30 发布 四川省质量技术监督局 2012 - 05 - 01 实施 发 布 DB51/T 1419—2012 目 次 前 言 ............................................................................... II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 形态与生物学特性 .................................................................. 1 5 临床诊断 .......................................................................... 2 6 实验室诊断 ........................................................................ 2 7 结果判定 .......................................................................... 3 附录A（资料性附录） 沙堡弱氏葡萄糖琼脂培养基 ........................................ 4 附录B（资料性附录） 试剂和染液配制 .................................................. 5 参考文献 ............................................................................. 6 I DB51/T 1419—2012 前 言 本标准由四川出入境检验检疫局提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准发布。 本标准起草单位：四川出入境检验检疫局、四川农业大学、中国保护大熊猫研究中心。 本标准主要起草人：余华、杨光友、严玉宝、张和民、李德生、陈世界、王承东、胡娟、崔鹏博、 周岷江。 II DB51/T 1419—2012 大熊猫须癣毛癣菌病检疫技术规范 1 范围 本标准规定了大熊猫须癣毛癣菌病的诊断与检疫方法。 本标准适用于大熊猫须癣毛癣菌病的常规诊断与检疫。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 541 动物疫病实验室检验采样方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 大熊猫须癣毛癣菌病 Trichophytosis for Giant panda 指须癣毛癣菌（Trichophyton mentagrophytes ）侵入大熊猫皮肤、黏膜及其附属物（毛发、爪等）， 并引起的一种感染性疾病。患病动物是本病的传染源，主要因接触而传染，也可经污染的用具或以饲养 管理人员为媒介等间接经皮肤接触而传染，一年四季均可发生，但以潮湿的春、秋两季较多见。 4 4.1 形态与生物学特性 分型 须癣癣菌（T.mentagrophytes)又称石膏样毛癣菌。该菌在葡萄糖蛋白胨琼脂上，28°C培养，生长迅 速。根据菌落形态，可分为羊毛状或绒毛状型、粉末状或颗粒状型2种类型。 4.2 特性 4.2.1 羊毛状或绒毛状型 白色羊毛状菌丝充满斜面，绒毛状菌丝短而整齐，整个菌落只占斜面的1/3～1/2。培养基背面颜色 为淡黄或棕黄色。镜检只见较细的，分隔菌丝和卵圆形小分生孢子，小分生孢子有时集聚成葡萄状，偶 见球拍状菌丝和结节状菌丝，无螺旋菌丝和大分生孢子。 4.2.2 粉末状或颗粒状型 菌落表面为粉末状，色黄，充满斜面，培养基背面为棕黄或棕红色，镜检可见多种菌丝，如螺旋菌 丝、球拍状菌丝、结节状菌丝等。小分生孢子呈球状，常聚成葡萄状。可见棒状大分生孢子，2～8个细 胞，大小为40～60μm×5～9μm，外壁薄而光滑。 1 DB51/T 1419—2012 5 临床诊断 成年及幼年大熊猫均可感染须癣癣菌。与其它外寄生虫混合感染时，兼有相应症状。单独感染大熊 猫时病初可见患部（四肢、背臀部、耳、腹部等处）小片状脱毛，皮肤发红，粗糙；有鳞屑痂皮，鳞屑 呈浅灰色至褐色；患部出现灰褐色痂皮损害。随着病程延长，脱毛面积加大，结有厚的鳞屑痂皮，去痂 皮后基底渗血，患处被毛失去光泽，不易折。 6 实验室诊断 6.1 直接涂片染色镜检法 6.1.1 试剂配制 10%KOH溶液配制见B.1；乳酸酚棉蓝染色液配制见B.2。 6.1.2 镜检方法 按照NY/T 541“样品的采集”有关章节要求，刮取每只疑似患病动物患处的鳞屑、痂皮、粘有渗出 液的被毛适量，将所取标本直接置于玻片上，滴加10%KOH溶液2滴，使之透明软化后再滴加乳酸酚棉 蓝染色液1滴，加盖玻片，在光镜下检查。观察到菌丝片段，即可初步判定有皮肤真菌感染。 6.2 病原菌分离 6.2.1 斜面培养法，又称大培养。 6.2.1.1 材料 沙堡弱氏葡萄糖琼脂培养基，制备见附录 A；待检标本；75%酒精；接种针；温箱。 6.2.1.2 方法 6.2.1.2.1 将待检标本（如皮屑、甲屑或脱落的毛）用 75%酒精浸泡数分钟，以杀死表面细菌，然后 用灭菌生理盐水充分洗涤。 6.2.1.2.2 按无菌操作法，用接种针将标本接种在含青霉素、链霉素的沙堡弱氏葡萄糖琼脂斜面培养 基上。 6.2.1.2.3 试管口用硫酸纸包好扎紧棉塞口，放置于 22℃温箱培养。 6.2.1.2.4 第 1 周观察 2 次，第 2 周隔日观察 1 次，3 周内不长出菌落，再重复做一次，若仍无菌落 生长，可报告阴性。须癣癣菌在培养基上菌落由白色短羽状变为粉末状，淡黄色，表面光滑，有 3～5 个同心圆，愈向外愈薄，菌落中心有纽扣状突起。随培养日期的延长，突起的表面产生短绒毛气生菌丝。 6.2.2 2 培养物的镜检 DB51/T 1419—2012 镜检培养物，可见有许多卵圆形的小分生孢子及不同直径，呈螺旋状、球拍状或破梳状的菌丝；或 镜检时见较细的，分隔菌丝和卵圆形小分生孢子，小分生孢子有时集聚成葡萄状，偶见球拍菌丝和结节 菌丝，无螺旋菌丝和大分生孢子。 7 结果判定 临床症状符合5，即可初步诊断为须癣癣菌病。在培养基上菌落的生长特性、菌落形态及镜检菌丝 和孢子的形态特征符合6.2.1.2.4和6.2.2即可判定为须癣癣菌病。 3 DB51/T 1419—2012 AA 附 录 A （资料性附录） 沙堡弱氏葡萄糖琼脂培养基 英文名称：SDB；Sabourauds Broth；Sabouraud Dextrose Broth 其他名称：沙堡氏4%葡萄糖琼脂肉汤；萨布氏葡萄糖琼脂肉汤 用途：用于真菌检测 配方： （g/L） 蛋白胨 10.0 葡萄糖 40.0 琼脂 20.0 pH值5.6 ± 0.2 25℃ 原理： 蛋白胨提供碳源和氮源；葡萄糖提供能源；琼脂是培养基的凝固剂。 用法： 称取本品 70.0 g,加热搅拌溶解于 1000 mL 蒸馏水中，116℃高压灭菌 20 分钟，不要过 分加热。 质量控制： 在25～28℃培养48～96小时。 质控菌株 4 菌株编号 生长情况 其它特征 黑曲霉菌 CMCC（F）98003 良好 白色菌落 酵母菌 白色念珠菌 ATCC18790 CMCC（F）98001 良好 良好 白色菌落 白色菌落 DB51/T 1419—2012 BB 附 录 B （资料性附录） 试剂和染液配制 B.1 10%KOH溶液 取KOH 10 g，加蒸馏水溶解定容至100 mL，即可。 B.2 乳酸酚棉蓝染色液 配方： 石碳酸 20 g 乳酸 20 mL 甘油 40 mL 棉蓝 0.05g 蒸馏水 20 mL 将棉蓝溶于蒸馏水中，再加入其它成分，微加热使其溶解，冷却后用。 5 DB51/T 1419—2012 参 考 文 献 [1] 赵长城，訾士鲁，李福宝. 兔皮肤真菌病的流行病学和诊断. 动物医学进展，2005，27（1）：104-107. [2] 雷培琪，尹才渊，李正昌，等. Wistar大白鼠石膏样毛癣菌病的实验观察. 中国人兽共患病杂志， 1994， 10（5）：44-45. [3] 周永华，杨凤翔，朱朝君，等. 大熊猫幼仔皮肤病的病原及防治研究. 重庆医科大学学报，1989， 14（2）：134-136. [4] 卢先雷. 临床真菌检验方法的选择和组合. 中华检验医学杂志，2004，27（3）：201-202. [5] 孙融冰，杜文金，黄引贤. 家兔皮肤真菌病的病原分离与鉴定. 中国人兽共患病杂志，2000，16 （5）:69-71. [6] 赵坤，张慧辉. 獭兔皮肤石膏样毛癣菌病的诊治. 畜牧与兽医，2000，16（5）:47-48. [7] 李寸欣，耿光瑞. 獭兔皮肤真菌病的诊断与防治. 中国养兔，2008，12：9. [8] 黄勉.大熊猫皮肤病的中西药治疗. 中兽医学杂志，2000,2:43. [9] 陈玉村.大熊猫真菌病和弥散性血管内凝血病例. 中国兽医杂志，2005，41（1）：60-61. [10] 邵海枫. 侵袭性真菌感染的常规微生物学检测. 临床检验杂志，2010，28（2）:90-93. [11] 张菁. 侵袭性真菌感染的实验室诊断. 医学综述，2009，15（24）:3812-3813. [12] 曹龙根，薛春娥，高庆田，等. 长毛兔石膏样毛癣菌病的调查. 中国兽医科技，1989，4:17. [13] 刘德昊，杨光友，赖松家，等. 四川地区兔脱毛癣病的病原学研究. 中国预防兽医学报，2006， 28（6）：622-624. [14] 邹立扣，曾博，王红宁，