ICS67.080.20 CCSB31 番茄及其制品中链格孢毒素的检测液相 色谱-串联质谱法 Determinationofalternariatoxinsintomatoanditsproductsby liquidchromatography-tandemmassspectrometry 2022-12-12发布 2022-12-12实施 新疆维吾尔自治区农学会发布新疆维吾尔自治区农学会团体标准 T/XAASS002-2022XAASS 全国团体标准信息平台 T/XAASS002—2022 前  言 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》 的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由新疆农业科学院提出。 本文件由新疆维吾尔自治区农学会归口。 本文件主要起草单位：新疆农业科学院、中国科学院上海营养与健康研究所、中粮屯河 番茄有限公司。 本文件主要起草人：王成、范盈盈、刘娜、武爱波、刘峰娟、李世翠、崔海滨、谭奇敏、 钦巧眉、韩杰、申玥琦、孙屏。 全国团体标准信息平台 T/XAASS002—2022 1番茄及其制品中链格孢毒素的检测液相色谱-串联质谱法 1范围 本文件规定了番茄及其制品（番茄酱、番茄汁、番茄丁、番茄沙司等）中的5种主要链 格孢毒素（链格孢烯、链格孢酚、链格孢酚甲基醚、细交链孢菌酮酸和腾毒素）的液相色谱 -串联质谱检测法。 本文件适用于番茄、番茄酱、番茄汁、番茄丁、番茄沙司等中的链格孢烯、链格孢酚、 链格孢酚甲基醚、细交链孢菌酮酸和腾毒素含量的测定和确证。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适 用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本文件。 GB/T601化学试剂标准滴定溶液的制备 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27417合格评定化学分析方法确认和验证指南标准 AOAC2021番茄、小麦和葵花籽中的链格孢毒素的测定液相色谱-串联质谱法 3术语定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4原理 试样中的链格孢烯、链格孢酚、链格孢酚甲基醚、细交链孢菌酮酸和腾毒素用甲醇/水/ 乙酸的混合溶液提取后，上清液经固相萃取柱净化，用超高压液相色谱分离，串联质谱检测， 同位素内标法定量。 5试剂和材料 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的一级水。 5.1甲醇，分析纯。 5.2甲醇，色谱纯。 5.3乙酸乙酯，分析纯或更高。 5.41%乙酸溶液：量取10mL质量分数大于等于99.7%的乙酸与990mL水混合均匀。 5.52.5%氢氧化铵溶液：量取1mL质量分数为25.0%的氢氧化铵与9mL水混合均匀。 5.6乙酸铵溶液（1mol/L）：称取77.08g乙酸铵，用水溶解并稀释至1000mL，摇匀。 5.72%聚山梨酯20溶液：量取2mL聚山梨酯20，用水溶解并稀释至100mL，摇匀。 5.8甲醇-水-乙酸溶液（85+14+1，体积比）：量取850mL甲醇、140mL水和10mL乙酸 混合均匀。 5.9甲醇-乙酸乙酯溶液（75+25，体积比）：量取750mL甲醇与250mL乙酸乙酯混合均 匀。 5.10乙酸铵缓冲液（5mmol/L，pH＝8.0）：量取5mL乙酸铵溶液（5.6），用LC-MS 级水溶解并稀释至1000mL，摇匀，用2.5%氢氧化铵（5.5）调节pH值在7.95至8.05之 全国团体标准信息平台 T/XAASS002—2022 2间。 5.11链格孢烯标准物质（Altenuene，ALT，C15H16O6，CAS：29752-43-0）：纯度大于等 于99.0%。 5.12链格孢酚标准物质（Alternariol，AOH，C14H10O5，CAS：641-38-3）：纯度大于等于 99.0%。 5.13链格孢酚甲基醚标准物质（Alternariolmonomethylether，AME，C15H12O5，CAS： 26894-49-5）：纯度大于等于99.0%。 5.14腾毒素标准物质（Tentoxin，TEN，C22H30N4O4，TEN，CAS：28540-82-1）：纯度大 于等于99.0%。 5.15细交链孢菌酮酸标准物质（Tenuazonicacid，TeA，C10H15NO3，CAS：610-88-8）：纯 度大于等于99.0%。 5.16ALT同位素标记内标ALT-d3：纯度大于98.0%。 5.17AOH同位素标记内标13C14-AOH：纯度大于98.0%。 5.18AME同位素标记内标13C15-AME：纯度大于98.0%。 5.19TEN同位素标记内标TEN-d3：纯度大于98.0%。 5.20TeA同位素标记内标TeA-d3：纯度大于98.0%。 5.21标准储备溶液：根据说明书中所示的浓度和不确定度，制备含浓度分别为100µg/mL 的AOH、AME、TEN和TeA标准溶液以及浓度为10μg/mL的ALT标准溶液，-18℃保存， 有效期1年。 5.22混合标准工作溶液：分别取适量的ALT、AOH、AME、TEN和TeA的标准储备溶液， 根据需要使用甲醇逐级稀释，配制成适当浓度的混合标准工作溶液。4℃保存，有效期7d。 5.23同位素标准储备溶液：根据说明书中所示的浓度和不确定度，制备含浓度分别为25 µg/mL的ALT-d3、13C14-AOH、13C15-AME、TEN-d3和TeA-d3标准溶液，-18℃保存，有效 期1年。 5.24同位素混合标准工作溶液，分别取适量的ALT-d3、AOH-13C14、AME-13C15、TEN-d3 和TeA-d3的标准储备溶液，根据需要使用甲醇逐级稀释，配制成适当浓度的混合标准工作 溶液。4℃保存，有效期7d。 5.25聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物固相萃取柱：HLB柱，6mL，200mg或者相当。使用前 依次用7mL的甲醇（5.1）、7mL水和7mL乙酸溶液（5.4）活化，保持柱体湿润。 5.26聚四氟乙烯，过滤器：0.2μm孔径。 6仪器和设备 6.1液相色谱-串联质谱仪：配有ESI电离源、串联四级杆质量分析器。 6.2pH计。 6.3分析天平：感量0.01g、0.0001g。 6.4振荡器。 6.5高速匀浆机。 6.6离心机：转速不低于3000r/m。 6.7固相萃取装置，带真空泵。 6.8漩涡混合器。 6.9减压旋转蒸发器。 6.10氮吹仪。 7分析步骤 7.1试样制备 取代表性样品约1kg，将其可食用部分切碎后，用高速匀浆机将样品加工成浆状，混匀， 装入洁净的样品瓶中，密封并标明标记，于-18℃冷冻保存。 注：在制样的操作过程中，应防止样品受到污染。 全国团体标准信息平台 T/XAASS002—2022 37.2提取 称取2g（精确至0.01g）试样于50mL离心管中，加入100μL同位素混合标准工作 溶液，加入14.0mL甲醇-水-乙酸溶液（5.8），振荡器提取45min，3000r/m离心10min， 将上层甲醇提取液转移7.5mL（等于1.0g样品）于新的50mL离心管中，用1%乙酸水溶 液（5.4）等体积稀释，待净化。 7.3净化 将稀释后的提取液（7.2）加入HLB固相萃取柱（5.25），以大约每秒1滴的流速流完， 依次用4mL聚山梨酯20溶液（5.7）、4mL乙酸溶液（5.4）淋洗，减压抽干。用7mL 甲醇-乙酸乙酯溶液（5.9）洗脱，保持每秒1滴的流速，收集洗脱液，50℃氮吹蒸发至干燥。 用400μL的甲醇（5.2）在漩涡混合器（6.8）上溶解，加入600μL乙酸铵缓冲液（5.10）， 再次在漩涡混合器（6.8）上溶解，过0.2μm聚四氟乙烯过滤器，供液相色谱-串联质谱测 定和确证。 7.4测定 7.4.1液相色谱参考条件 a）色谱柱：T3柱，长100mm，内径2.1mm，粒径2.5μm，或相当者； b）流动相：甲醇（5.2）-乙酸铵缓冲液（5.10）梯度洗脱，参见表1，梯度变化模 式为线性递增或者递减； 表1流动相条件 时间 min流速 mL/min甲醇 %乙酸铵缓冲液 % 0.00 0.3 10 90 1.00 0.3 10 90 10.00 0.3 100 0 12.00 0.3 100 0 12.20 0.3 10 90 16.00 0.3 10 90 c）柱温：30℃； d）进样体积：5μL； 7.4.2质谱参考条件 质谱检测参考条件见附录A。 7.5液相色谱-串联质谱检测及确证 7.5.1定性测定 对标准工作液及样液按7.4规定的条件进行测定时，如果样液与标准工作液的选择离子 图中，样液中目标化合物的保留时间与相近浓度标准溶液的保留时间相偏差在±2.5%以内。 每种化合物的质谱定性离子应出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，而且同一检 测批次，对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶 液相比，其允许偏差不超过表2规定的范围，则可判断样品中存在目标化合物。 表2定性时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 ＞50% ＞20%~50%＞10%~20% ≤10% 允许的相对偏差 ±20% ±25% ±30% ±50% 7.6标准曲线的制作 在7.4液相色谱串联质谱仪分析条件下，将标准系列溶液由低到高浓度进样检测，以链 全国团体标准信息平台 T/XAASS002—2022 4格孢毒素色谱峰与各对应内标色谱峰的峰面积比值-浓度作图，得到标准曲线回归方程，其 线性相关系数应大于0.99。 7.7试样溶