ICS 11.220 CCS B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T41698—2022 鸭源生物制品外源病毒检测方法 Detection of extraneous viruses in biological products derived from duck 2023-05-01实施 2022-10-12发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T41698—2022 目 次 前言 引言 范围 2 规范性引用文件 3 术语和定义、缩略语· 免疫血清的制备及采集 5 抗体检测 5.1 鸭瘟病毒（DPV)ELISA抗体检测 5.2 鸭肝炎病毒I型（DHVI）中和试验· 5.3 鸭坦布苏病毒（DTMUV）血凝抑制试验 5.4 鸭坦布苏病毒（DTMUV)ELISA抗体检测 5.5 番鸭细小病毒（MPV)胶乳凝集抑制试验· 5.6 番鸭小鹅瘟病毒（GPV）胶乳凝集抑制试验 6外源病毒检验结果综合判定 附录A（规范性） 溶液配制 14 GB/T41698—2022 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 本文件由全国质量监管重点产品检验方法标准化技术委员会（SAC/TC374）提出并归口。 本文件起草单位：中国兽医药品监察所。 本文件主要起草人：赵耘、王芳、滕颖、孟杰、郑存哲、王小蕾、李泽君、刘月焕、陈少莺、宫晓、曲鸿飞 杨承槐、杨宵玥、薛峰、陈冬阳。 GB/T41698—2022 引 我国鸭养殖数量位居世界首位，近年来鸭的疫病日益增多，生产和使用的鸭源生物制品种类越来越 多。外源病毒检验是病毒类活疫苗质量控制项目之一，对保证产品质量至关重要。《中国兽药典》（2020年 版附录中关于禽源生物制品外源病毒检验的相关方法和标准主要是针对鸡源或鸡用制品，缺少鸭源生 毒检验的关键参数、目前主要流行的鸭病毒病现状以及检测方法研究成熟度，制定鸭瘟病毒、鸭肝炎病 毒I型、鸭坦布苏病毒、番鸭细小病毒、番鸭小鹅瘟病毒5种病毒的鸡检测方法 GB/T41698—2022 鸭源生物制品外源病毒检测方法 1范围 本文件描述了用鸡进行鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒工型、鸭坦布苏病毒、番鸭细小病毒、番鸭小鹅瘟病毒 的鸭源生物制品外源病毒检测的方法。 本文件适用于鸭源生物制品（活疫苗及生产毒种）中外源病毒的检测 2规范性引用文件 2 本文件没有规范性引用文件。 3术语和定义、缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 biological productsderivedfromduck 鸭源生物制品 以天然或人工改造的鸭源微生物、寄生虫、生物毒素或鸭源生物组织及代谢产物等为材料，采用生 物学、分子生物学或生物化学、生物工程等相应技术制成的，用于预防、治疗、诊断鸭疫病的产品 3.1.2 活疫苗livevaccines 来源于田间弱毒株或采用物理、化学或生物学致弱方法获得的弱毒株，经培养繁殖后制备的疫苗。 3.1.3 毒种seed 具有一定数量、背景明确、组成单一、经系统鉴定免疫原性和繁殖特性良好、生物学特性和鉴别特征 明确、纯净、用于兽用生物制品研制、生产和检验的病毒 3.1.4 外源病毒检验 testforextraneous viruses 对可能因生产工艺、原辅材料等造成外源性病毒污染制品而进行的一类检验 3.1.5 无特定病原鸡 specificpathogenfreechicken 在屏障环境或隔离环境的饲养条件下，不含有鸡白痢沙门氏菌、副鸡嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、鸡 毒支原体、滑液支原体、禽流感病毒、鸡新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性 喉气管炎病毒、淋巴白血病病毒、网状内皮增生症病毒、马立克氏病病毒、鸡传染性贫血病毒、禽呼肠孤 病毒、禽脑脊髓炎病毒、禽腺病毒Ⅲ群、禽腺病毒I群、禽痘病毒等19种特定病原微生物，可用于微生物 学监测的鸡。 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 1 GB/T41698—2022 BABS：牛血清白蛋白硼酸氯化钠溶液（bovineserumalbuminboricacidsodiumchloridesolution） DHVI：鸭肝炎病毒I型（duckhepatitisvirus-typeI） DPV：鸭瘟病毒（duckplaquevirus） DTMUV：鸭坦布苏病毒（ducktembusuvirus） ELDso：鸡胚半数致死量（MedianEmbryoLethalDose)） ELISA：酶联免疫吸附测定（enzymelinkedimmunosorbentassay） GPV：番鸭小鹅瘟病毒（goslingplaguevirus） HA：血凝（hemagglutination) HAU：血凝单位（hemagglutinationunit） HI：血凝抑制（hemagglutinationinhibition） LPA：胶乳凝集（latexparticlesagglutination） LPAI：胶乳凝集抑制（latexparticlesagglutinationinhibition） MPV：番鸭细小病毒（mmuscovyducklingparvovirus） OD：光密度（opticaldensity） PBS：磷酸盐缓冲溶液（phosphatebufferedsaline） SPF：无特定病原体（specificpathogenfree） TMB3.3'5.5-四甲基联苯胺（3,3，5.5-Tetramethylbenzidine） VAD：病毒调整稀释液（virusadjustingdiluent） 4免疫血清的制备及采集 4.1取至少2瓶鸭源生物制品，按瓶签注明羽份稀释，混匀后备用。 4.2取20只2周龄3周龄无特定病原鸡（SPF鸡），每只同时点眼、滴鼻接种各10羽份制品（4.1），肌 肉注射100羽份制品（4.1），21d后，按上述方法和剂量重复接种1次。第1次接种后观察临床症状至 第42天并经翅静脉或心脏采血，分离血清。 5抗体检测 5.1 鸭瘟病毒（DPV)ELISA抗体检测 5.1.1原理 将抗原吸附在固相载体上，加人待检抗体，孵育后再加入针对抗原的单克隆抗体，没有完全被待检 血清中抗体结合的抗原即可和后加入的单克隆抗体结合，加入相应的酶标记抗体后，形成抗原-待测抗 体复合物、抗原-单克隆抗体-酶标抗体复合物。抗原-单克隆抗体-酶标抗体复合物能与该酶的底物反应 生成有色产物。使用酶标测定仪测定反应物的光密度值（OD值），通过计算对被检测抗体进行定性。 5.1.2试剂和材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。低温储存的试剂恢复至20℃25℃后待用，液体试剂使用前 混匀。 5.1.2.1 终止液，2mol/L的HzSO4。 5.1.2.2 TMB底物溶液，商品化的TMB底物溶液。 5.1.2.3 样品稀释液（商品化抗体稀释液）。 5.1.2.4 4洗涤液：分别称取80.00gNaCl、2.00gKCl、2.00gKH,PO、11.50gNazHPO，溶于800mL去离 2 GB/T41698—2022 子水，调pH至7.1~7.3，添加去离子水至1L，加入硫柳汞至终质量浓度为0.01g/mL，加人5mL Tween-20（聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯），混匀，0.22um滤膜过滤除菌，无菌分装。使用前用去离 子水或蒸馏水稀释10倍。 5.1.2.5羊抗鼠酶标抗体，商品化的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体。 5.1.2.6抗原包被板，用灭活后纯化的鸭瘟病毒（SH2017株）包被的96孔酶联反应板。 5.1.2.7鸭瘟病毒阳性对照血清，中和效价1：2~1：8。 5.1.2.8 阴性对照血清，中和抗体效价低于1：2。 5.1.2.9 鸭瘟病毒单克隆抗体，中和抗体效价不低于1：4。 5.1.3仪器和设备 5.1.3.1 单道和多道微量移液器（10uL~100μL、1000μL）。 5.1.3.2 酶标仪。 5.1.3.3洗板机。 5.1.4血清样品的处理 5.1.4.1 血清样品的存放与运送：血清样本置一20℃及以下冷冻保存，避免反复冻融。采集的血清样 本可用冰袋或保温桶加冰密封等方式运输。运输时间应尽量缩短。 5.1.4.2样品稀释：将待检血清用样品稀释液（5.1.2.3）按1：10稀释后进行测定 5.1.5试验步骤 5.1.5.1加样与孵育：取抗原包被板（5.1.2.6），分别将阴性对照血清（5.1.2.8）、鸭瘟病毒阳性对照血清 （5.1.2.7)和稀释好的待检血清（5.1.4.2）加人到抗原包被板孔中，各2孔，100μL/孔。轻轻振匀孔中样 品，用封板膜密封包被板，置37℃孵育1h。 5.1.5.2洗涤：去除封板膜，弃去孔中液体，每孔加入300μL洗涤液（5.1.2.4），作用3min，弃去洗涤液， 重复洗涤3次。可用洗板机（5.1.3.3）或手动洗涤。 被板，置37℃孵育1h。 5.1.5.4洗涤：按5.1.5.2中方法洗涤。 5.1.5.5 与酶标抗体作用：每孔加入羊抗鼠酶标抗体（5.1.2.5）100μL，用封板膜密封包被板，置37℃孵 育1h。 5.1.5.6 洗涤：按5.1.5.2中方法洗涤。 5.1.5.7 5.1.5.8 终止：每孔加人终止液（5.1.2.1）50uL，置酶标仪（5.1.3.2）在OD450nm波长下测定各孔 OD值。 (PI)大于或等于50%，判定检测结果有效 5.1.6结果计算 阻断率（