ICS 71.100.70 Y 42 GD 中华人民共和国国家标准 GB/T33309—2016 化妆品中维生素B。（吡哆素、盐酸吡哆素、 吡哆素脂肪酸酯及吡哆醛5-磷酸酯） 的测定‧高效液相色谱法 Determination of vitamin B, ( pyridoxine,pyridoxine hydrochloride, pyridoxine fatty acid esters and pyridoxal 5-phosphate ) in cosmetics- High performance liquid chromatography 2016-12-13发布 2017-07-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T33309—2016 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中国轻工业联合会提出。 本标准由全国香料香精化妆品标准化技术委员会（SAC/TC257）归口。 日用化学工业研究所。 本标准主要起草人：霍艳敏、王骏、张娟、张卉、周莉莉、段文增、邹惠玲、干艳丽、薛霞、宿书芳、 刘艳明、崔玉花、刘桂亮、张艳侠、沈敏 I GB/T33309—2016 化妆品中维生素B（吡哆素、盐酸吡哆素、 吡哆素脂肪酸酯及吡哆醛5-磷酸酯 的测定高效液相色谱法 1范围 本标准规定了化妆品中维生素B（吡哆素、盐酸吡哆素、吡哆素脂肪酸酯及吡哆醛5-磷酸酯）的高 效液相色谱测定方法。 本标准适用于膏霜、乳液、液体类等化妆品中吡哆素、盐酸吡哆素、吡哆素脂肪酸酯及吡哆醛5-磷 酸酯的测定。 本标准方法检出限为：吡哆醛1.0mg/kg、吡哆素0.3mg/kg，定量限为：吡哆醛2.5mg/kg、吡哆素 1.2 mg/kg. 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3原理 本标准通过酶解、皂化反应将样品中的维生素B。均转化为吡哆素或吡哆醛的形式，利用高效液相 4 试剂和材料 除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1甲醇：色谱纯。 4.2七氟丁酸：色谱纯。 碱性磷酸酶：酶活力不小于10U/mg。 4.4 磷酸：优级纯。 4.5 氨水：优级纯，含量为25%~28%。 4.6 磷酸二氢铵：优级纯。 4.7 磷酸氢二钠(Na2HPO4·2H,O)。 4.8乙醇。 4.9盐酸。 4.10 ：氢氧化钾水溶液：称取固体氢氧化钾250g，加入200mL水溶解。 4.11 30%磷酸水溶液（体积分数）：准确量取30mL磷酸（4.4）和70mL水，混匀后备用。 4.12 30%氨水溶液（体积分数）：准确量取30mL氨水（4.5）和70mL水，混匀后备用 1 GB/T33309—2016 4.13盐酸溶液（5.0mol/L，0.1mol/L）：量取40mL、0.8mL盐酸（4.9）分别放人两个100mL容量瓶 中，用水定容，分别得5.0mol/L,0.1mol/L盐酸溶液。 4.14氢氧化钠溶液（5.0mol/L,0.1mol/L）：称取20g、0.4g氢氧化钠用水溶解，分别放人两个100mL容 量瓶中，用水定容，分别得5.0mol/L、0.1mol/L氢氧化钠溶液。 4.15离子对试剂缓冲溶液[0.02mol/L磷酸二氢铵缓冲溶液（含0.001mol/L七氟丁酸)]：称取2.30g磷 酸二氢铵，加人约980mL水溶解，用30%磷酸（4.11)或30%氨水（4.12）调节pH值至4.5，加人170μL 七氟丁酸（4.2），用水定容至1L备用。 4.16磷酸氢二钠溶液（0.1mol/L）：称取17.8g磷酸氢二钠（4.7），用水溶解，定容至1000mL，用氢氧 化钠溶液（4.14）调节pH值至9.8，备用 4.17碱性磷酸酶溶液（1.0g/L)：称取50mg碱性磷酸酶，用水定容至50mL。临用前配制。 4.18标准样品：吡哆素和吡哆醛，纯度不小于99.0%。维生素B（吡哆素、盐酸吡哆素、吡哆素脂肪酸 酯和吡哆醛5-磷酸酯）的CAS号、分子式、相对分子质量、化学结构式参见附录A。 4.19维生素B（吡哆素、吡哆醛）标准贮备液（1mg/mL）：准确称取0.025g（精确至0.0001g）吡哆 素、吡哆醛标准品，分别置于25mL容量瓶中，用水溶解定容，配制成浓度为1mg/mL的标准储备液， 于4℃避光保存，有效期3个月。 别准确吸取维生素B标准贮备液（4.19）5mL、0.5mL至50mL容量瓶中，用水溶解、定容，混匀。 4.21维生素B（吡哆素、吡哆醛）混合标准系列工作液：分别准确吸取维生素B混合标准中间液2（4.20） 溶解定容。该标准系列浓度分别为0.01μg/mL、0.1μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、 20.0μg/mL。临用前配制。 4.22微孔滤膜：0.45μm，有机相。 5仪器和设备 5.17 高效液相色谱（HPLC)仪：配有荧光检测器。 5.2 分析天平：感量为0.0001g和0.01g 5.3 涡旋混合器。 5.4水浴振荡器。 5.5 pH计。 5.6 具塞塑料离心管：50mL。 6分析步骤 6.1 试样处理 6.1.1试样标签中标注含吡哆醛5-磷酸酯的试样 称取1.0g混合均匀试样（精确至0.0001g）置于50mL具塞塑料离心管（5.6）中，加人1.0mL碱 性磷酸酶溶液（4.17）、用磷酸氢二钠溶液（4.16）定容至10.0mL，用涡旋混合器（5.3）充分混匀，置于水 浴振荡器（5.4）上，于（37士1)℃振荡酶解12h以上。 6.1.2试样标签中标注含吡哆素、盐酸吡哆素及吡哆素脂肪酸酯的试样 称取1.0g混合均匀试样（精确至0.0001g）置于50mL具塞塑料离心管（5.6）中，加入10.0ml 2